树莓总多酚及其抗氧化功能研究

王丽，王振宇，2＊，樊梓鸾，左丽丽

（1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

树莓也称悬钩子，悬钩子属是蔷薇科（Rosaceae） 中的一个大属，全世界已知有750余种，主要分布在北半球温带和寒带，亚洲是世界树莓属中心。我国树莓属种类繁多，约有210多种，北到大兴安岭，南至海南，东至台湾，西到新疆，均有分布，主要以长江以南及西北地区多见，因其茎上有刺如悬钩，故名之［1］。

现代医学研究发现，树莓属植物具有抗氧化、抗菌、抑癌、降糖、心血管保护等多种作用，其主要活性成分为多酚类化合物［2］。多酚（polyphenols）是植物代谢过程中的次生代谢产物。存在于许多水果、蔬菜以及各种香辛料、谷物、豆类、果仁中［3］。酚类化合物是一类具有大而复杂基团的化合物，从化学上讲多酚以苯酚为基本骨架，以苯环的多羟基取代为特征，主要由无色多酚和色素两类物质组成。从低分子量的简单酚类到分子量大至数千道尔顿的单宁类，按结构可分为酚酸类（phenolic acids）、类黄酮类（flavonoids）及1，2－二苯乙烯（stilbenes）、花青素类和原花色素类等，目前已经分离鉴定了8000多种多酚类物质［4］。

常见水果中的总酚类化合物以游离和结合两种形式存在，其中结合型约占24%，主要是游离型。资料报道用丙酮提取的苹果总酚类化合物中游离型占91.8%，结合型为8.2%，因此通常用丙酮提取游离型酚类和类黄酮［5－6］。

1 材料与方法

1.1 实验材料

树莓，购买于黑龙江省哈尔滨市。

1.2 实验仪器

九阳料理机；高剪切分散乳化机；旋转蒸发仪；722可见分光光度计；电子天平；架盘药物天平。

1.3 实验方法

1.3.1 树莓总多酚的提取工艺流程

树莓（鲜果）→80%冷冻的丙酮（W／V，1／2），榨汁机匀浆（3min）→均质机均质（3min）→布氏漏斗抽滤→将滤液用旋转蒸发仪浓缩→蒸馏水定容→含多酚的粗提物

操作要点：称取冻存的鲜果，以1／2的料液比加入80%的丙酮，榨汁匀浆3min，在16000rpm转速下均质3min，用布氏漏斗抽滤，将滤液用旋转蒸发仪以转速30r／min，温度45℃，浓缩，用蒸馏水定容，获得的粗提物溶液放在－20℃保存［7］。

1.3.2 总多酚的含量测定

本实验用福林酚法测定总多酚的含量。

称取没食子酸50mg溶解于10mL乙醇（100%），即为没食子酸标准母液。将标准母液分别稀释成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4mg／mL的标准溶液。分别取125μL标准溶液，加入125μL FCR混合静置6min，加入7%Na2CO3（1.25mL），用水调至3mL（加水1.5mL），放置90min，760nm测定吸光度［8］，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。

样品测定：取一定量树莓提取液，蒸馏水稀释10倍。取稀释后的溶液125μL，按上述步骤操作测定吸光度，以标准曲线回归方程计算总多酚含量。

总多酚含量（mg／100g）＝回归浓度×稀释倍数×提取液体积／原料鲜重／100

1.3.3 体外抗氧化的测定

1.3.3.1 清除 ABTS自由基能力

在734nm下，稀释ABTS母液至A0＝0.700～0.800，然后将稀释的样品0.1mL与1.4mL稀释后的ABTS混合，暗处反应6min，在734nm下测定不同梯度样品的吸光度A［9］。Trolox为阳性对照。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.2 清除DPPH自由基能力

取4.7g DPPH，加入100mL无水乙醇溶解（吸光度 A0＝0.700～0.800），将不同梯度的样品稀释液0.1 mL与1.4mL DPPH暗处反应30min后，在517nm下测定吸光度A。Trolox为阳性对照［10］。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.3 清除羟基自由基能力

在反应管中依次加入0.2mL样品，0.8mL FeSO4（500μM），0.2mL EDTA （1mM），0.2mL H2O2（10mM），0.2mL 2－脱氧核糖（15mM），在37℃下反应30min，然后加入1.4mL TCA－TBA－HCl混合溶液，沸水浴15min，迅速冷却后，在532nm下测定吸光度A。空白不加入FeSO4和H2O2，标准管用蒸馏水代替样品测定吸光度A0［11］。抗坏血酸为阳性对照。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.4 清除超氧阴离子自由基能力

样品管中依次加入1mL Tris－HCl（16mmol／L，pH＝8.0），0.5mL NADH（600μg／mL），0.6mL NBT（410μg／mL），0.2mL样品溶液，加入 0.2mLPMS（138μg／mL）后，室温反应5min，在560nm处测定吸光度A。空白不加PMS，标准管用蒸馏水代替样品测定吸光度A0［12］。抗坏血酸为阳性对照。清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

2 结果与分析

2.1 总多酚含量测定

图1 福林酚法标准曲线

测得的标准曲线见图1，回归方程见式（2－1），方程的拟和度R2≈0.9994。

式中：y—溶液在760nm处的吸光度；

x—溶液中的没食子酸含量（mg／mL）。

根据标准曲线得树莓的总多酚含量为708.54mg／100g鲜果。

2.2 体外抗氧化的测定

2.2.1 清除 ABTS自由基

ABTS二铵盐与过硫酸铵反应生成蓝绿色ABTS＋·，在734nm处有强吸收。当加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，最大吸收波长处的吸收减弱。

IC50值即清除50%自由基时，所需要的样液的浓度。故IC50值越小，样液清除自由基能力越强。

如图2所示，树莓提取液对ABTS自由基的清除能力随浓度增加而增强，具有明显的量效关系，Trolox亦之。树莓提取液对ABTS自由基的半清除率IC50为5.04mg／mL，Trolox对ABTS自由基的半清除率IC50为70.84mg／mL。说明相同条件下，树莓提取物比Trolox清除ABTS自由基的能力强。

图2 清除ABTS自由基能力

2.2.2 清除DPPH自由基

图3 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517nm处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。

如图3所示，树莓提取液对DPPH自由基的清除能力随浓度增加而增强，具有明显的量效关系，Trolox亦之。树莓提取液对DPPH自由基的半清除率IC50为9.54mg／mL，Trolox对DPPH自由基的半清除率IC50为89.39mg／mL。说明相同条件下，树莓提取物比Trolox清除DPPH自由基的能力强。

2.2.3 清除羟基自由基能力

α－脱氧核糖法评价清除·OH－－能力是基于Fenton反应，其原理如下：

采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（Fenton反应），当反应体系中存在自由基清除剂时，·OH－被部分清除，丙二醛生成量减少，粉红色化合物生成量减少，532nm下吸收减弱。

如图4所示，树莓提取液对羟自由基的清除能力随浓度增加而增强，具有明显的量效关系，抗坏血酸亦之。树莓提取液对羟自由基的半清除率IC50为3.85 mg／mL，抗坏血酸对羟自由基的半清除率IC50为3.14 mg／mL，表明相同条件下，树莓提取物与抗坏血酸清除羟自由基的能力接近。

图4 清除羟自由基能力

2.2.4 清除超氧阴离子自由基能力

在碱性条件下，PMS催化NADH产生·O2－，在反应体系中加入NBT可产生蓝色物质，当反应体系中加入抗氧化剂时，·O2－被部分清除，与NBT产生的蓝色物质的量减少，因此通过反应体系的吸光度值变化可测定此化合物清除·O2－的能力，间接反映出抗氧化剂的抗氧化活性。

如图5所示，树莓提取液对超氧阴离子自由基的清除能力随浓度增加而增强，具有明显的量效关系，抗坏血酸亦之。树莓提取液对超氧阴离子自由基的半清除率IC50为11.96mg／mL，当提取液浓度为40mg／mL时，清除率可达到94.74%。相同条件下，抗坏血酸对超氧阴离子自由基的半清除率IC50为4.77mg／mL，表明，树莓提取液具有较好的清除超氧阴离子自由基的能力。

图5 清除超氧阴离子自由基能力

3 结论

本实验采用溶剂提取法，得到树莓总多酚含量为708.54mg／100g鲜果。

通过测定清除ABTS、DPPH、·OH－、·O2－自由基，4个指标来评价树莓提取物的体外抗氧化能力。

3.1 随树莓提取液的浓度增加，抗氧化能力越强。而且树莓提取液对ABTS自由基比较敏感，浓度为5.04 mg／mL时，清除率就可以达到50%。对DPPH自由基的清除能力较强，浓度为9.54mg／mL时，清除率就可以达到50%。而且树莓提取液对ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用要比Trolox的作用强，高约10倍。

3.2 树莓提取液清除羟自由基的能力较强，浓度为3.85mg／mL时，清除率就可以达到50%，与抗坏血酸的清除能力相近。对超氧阴离子的清除能力也较强，浓度为11.96mg／mL时，清除率就可以达到50%。

总体来讲，树莓提取液对非生理性自由基有很强的清除作用，而对生理性自由基的清除能力不如抗坏血酸，但上述结论充分证明其具有较强的抗氧化作用，这可能与树莓中含有大量的多酚有关。医学研究表明，多酚类化合物通过清除自由基，能对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，维持细胞膜的流动性和蛋白质的构型构象，防止辐射诱发的DNA断裂［13］，对自由基引起的疾病有很好的预防作用，因此多酚化合物又可叫做自由基吸收剂。本实验的研究对于利用树莓开发天然抗氧化功效因子提供了依据。但由于本研究仅是在体外进行的实验，而生物体内的氧化代谢是很复杂的，因此，还有待于从生物体内源抗氧化酶系活性和生物大分子氧化代谢产物水平的角度来进一步研究树莓的抗氧化作用。

［1］韩加，刘继文.树莓属植物生物学作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2009，28（2）：1－8.

［2］傅正生.树莓属植物化学成分及生物活性研究新进展［J］.天然产物研究与开发，2001，13（5）：86－91.

［3］冯丽，宋曙辉，赵霖，等.植物多酚种类及其生理功能的研究进展［J］.江西农业学报2007，19（10）：105－107.

［4］吴琼，白兆鹏，刘佰.茶多酚及其生物学功能［J］.养殖与饲料，2007（1）：57－61.

［5］Szajdek A，Borowska EJ.Bioactive Compounds and Health－Promoting Properties of Berry Fruits：A Review.Plant Foods for Human Nutrition，2008，63（4）：147－156

［6］Shiow Y.Wang，Chi－Tsun Chen，Chien Y.Wang.The influence of light and maturity on fruit quality and flavonoid content of red raspberries.Food Chemistry，2009，112（3）：676－684.

［7］Jie Sun，Yi－Fang Chu，et al.，Antioxidant and Antiproliferative Activities of Common Fruits［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：7449－7454.

［8］Katherine J.Meyers，ChristopHer B.Watkins，Marvin P.Pritts，and Rui Hai Liu.Antioxidant and Antiproliferative Activities of Strawberries［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51 （23）：6887－6892.

［9］Zhao，H.F.，W.F.Chen，ect.Phenolic profiles and antioxidant activities of commercial beers［J］.Food Chemistry，2010，119（3）：1150－1158.

［10］Mohammad Ali Esmaeili，Ali Sonboli.Antioxidant，free radical scavenging activities of Salvia brachyantha and its protective effect against oxidative cardiac cell injury［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48：846－853.

［11］张欣，赵新淮.几种多酚化合物抗氧化性的不同化学评价及相关性分析［J］.食品科学，2008，29（10）：85－89.

［12］Zhang，Z.S，Zhang，Q.B，Wang，J，ect.Regioselective syntheses of sulfated porphyrans from Porphyra haitanensis and their antioxidant and anticoagulant activities in vitro［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79：1124－1129.

［13］Chung S.Yang，Joshua D.Lambert，Shengmin Sang.Antioxidative and anticarcinogenic activities of tea polyphenols［J］.Arch Toxicol，2009，83：11－21.