高效液相色谱法同时测定人血浆中多种喹诺酮类药物浓度

温中明，李 东，徐玉红

(1.广东省深圳市光明新区公明人民医院药剂科，广东 深圳 518106;2.暨南大学第二临床医学院·深圳市人民医院临床药学室，广东 深圳 518020;3.广东医学院附属深圳福田人民医院药剂科，广东 深圳 518033)

喹诺酮类药物的杀菌效果呈浓度依赖性，浓度越高，抗菌活性越强，最大血药浓度与最低抑菌浓度的比值(Cmax/MIC)大于8～10时，呈明显杀菌活性，且可减少耐药菌株的产生。但随着浓度增加，药物不良反应明显增加，对于某些特殊患者，抗菌药物的血药浓度监测具有明显的临床意义。有关血样中喹诺酮类药物的含量测定方法报道很多[1－8]，但测定不同的喹诺酮类药物，文献报道所使用的仪器、色谱条件以及样品处理方式各不相同，有些方法对实验设备或技术要求较高，基层实验室难以满足。为此，笔者建立了一种血样处理相对简单、条件易于满足、检测灵敏度高的方法，可用于多种喹诺酮类药物的测定，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括G 1311 A四元泵，G 1322 A真空脱气机，G 1315 B－DAD检测器，D 1316 A柱温箱，rheodyne－7725i进样器，ChemStation色谱工作站;AG 285型电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);XW－80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);KQ 5200 DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速离心机(雅培公司);pHS－3C数字pH计(上海精科雷磁仪器厂)。氧氟沙星对照品、洛美沙星对照品、加替沙星对照品、司帕沙星对照品均购自中国药品生物制品检定所;盐酸莫西沙星对照品由拜耳医药保健有限公司提供;甲醇、乙腈为一级色谱纯，均购自天津四友精细化学品有限公司;水为注射用水，其他试剂为分析纯。所有试液使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Kromasil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(调pH至3.0)－甲醇－乙腈 (65∶20 ∶15);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。检测波长依测定物进行调整以提高检测灵敏度，检测模型药物莫西沙星时波长设定为296 nm。在此条件下，氧氟沙星、洛美沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星均能依次得到分离，其中加替沙星和莫西沙星的保留时间分别约为5.8 min和7.6 min，理论板数按莫西沙星计算不低于8 000。色谱图见图1。

图1 人血浆中5种喹诺酮类抗菌药物高效液相色谱图

2.2 溶液配制

精密称取干燥至恒重的各对照品10.0～20.0 mg，置10 mL量瓶中，以注射用水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别得质量浓度为1 000.0～2 000.0 μg/mL 的对照品贮备液，置 4 ℃冰箱中备用。莫西沙星对照品贮备液的质量浓度为1 000.0 μg/mL，临用时分别精密量取适量于10 mL量瓶中，以流动相稀释至刻度，得质量浓度分别为 2.5，5，10，20，40，80，160，250 μg/mL 的系列莫西沙星对照品工作液。加替沙星对照品贮备液的质量浓度为1 000.0 μg/mL，作内标时的质量浓度为20.0 μg/mL。精密称取磷酸二氢钾2.72 g，加适量蒸馏水溶解后加入10 mL三乙胺，边加边搅拌，以蒸馏水定容至1 000 mL，用分析纯浓磷酸调 pH至3.0，即得浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液。

2.3 血浆样品预处理

将全血样品4 mL置肝素抗凝管中，静置30 min，以3 000 r/min离心10 min。取上清液，置1.5 mL离心管中，密封，标记，－20℃保存至分析。分析前，血浆样品于室温下自然解冻后，精密吸取0.5 mL，置10 mL具塞锥形离心管中，加内标溶液适量，旋涡混合30 s，加入二氯甲烷5 mL，旋涡提取5 min，10 000 r/min离心10 min，取二氯甲烷层，50℃水浴氮气流吹干，残渣以100 μL流动相旋涡30 s溶解，再以10 000 r/min离心3 min后取20 μL进样。以加替沙星为内标测定模型药物莫西沙星时，20.0 μg/mL的加替沙星内标溶液的加入量为 15 μL。

2.4 方法学考察

专属性试验:分别取6名健康体检者的混合空白血浆0.5 mL，按2.3项下操作，获得空白血浆样品的典型色谱图1A;将不同质量浓度的5种喹诺酮类药物对照品溶液10 μL加入至0.5 mL混合空白血浆中，同法操作，获得典型色谱图1B。将一定质量浓度莫西沙星对照品溶液10 μL加入0.5 mL混合空白血浆中得0.2 μg/mL莫西沙星对照品血样，同法操作，获得典型色谱图1C;取健康受试者单剂量口服400 mg盐酸莫西沙星片剂后12 h的血浆样品，同法操作，得色谱图1D。结果表明，在筛选出的样品处理条件及色谱条件下，血浆中内源性物质及代谢物均不干扰样品测定，峰形对称性好，基线噪音小(图1)。

线性范围考察及检测限:以莫西沙星为模型药物，对方法学进行验证。取10 mL具塞锥形离心管9支，分别精确加入健康体检者空白血浆0.5 mL，除空白管外，每支管精确加入不同质量浓度的莫西沙星对照品工作液10 μL，涡旋混合30 s，使质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20，5.00 μg/mL，按 2.3 项下方法操作，分别记录莫西沙星峰面积(As)及内标峰面积(Ai)，以莫西沙星与内标峰面积比值(As/Ai)对莫西沙星质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程 As/Ai=2.119 4 C －0.077 9(r=0.999 8)。结果表明，莫西沙星质量浓度线性范围是 0.05～5.00 μg/mL。莫西沙星的最低定量限为 0.05 μg/mL，检测限为 0.015 μg/mL(RS/N=3)。

方法精密度:用空白血浆及对照品溶液配制质量浓度为0.10，1.60，5.00 μg/mL 的 3 种莫西沙星质控样品，各 6 份，按 2.3 项下方法操作，于1 d内各浓度重复测定6次;连续6 d，每天配制上述3种质量浓度的莫西沙星样品进行测定，将测定结果比值代入回归方程，计算日内、日间精密度。结果见表1。

表1 方法日内及日间精密度试验结果(±s，n=6)

表1 方法日内及日间精密度试验结果(±s，n=6)

质量浓度(μg/mL)日内精密度 日间精密度0.10 1.60 5.00测定浓度(μg/mL)0.11 ± 0.006 1.62 ± 0.065 4.96 ± 0.22 RSD(%)5.73 4.03 4.45测定浓度(μg/mL)0.11 ± 0.008 1.65 ± 0.07 5.02 ± 0.27 RSD(%)6.83 4.53 5.43

回收率:用空白血浆0.5 mL和莫西沙星对照品溶液适量，配制质量浓度为 0.10，1.60，5.00 μg/mL 的 3 种莫西沙星质控样品，各6份，按2.3项下方法操作，测定。将莫西沙星与加替沙星峰面积比代入线性方程，计算质量浓度，测定质量浓度与加入质量浓度的比值即为方法回收率。另取空白血浆0.5 mL，不加入莫西沙星及内标工作液，按2.3项下方法处理，在取二氯甲烷层后加入相同量的莫西沙星及内标工作液，旋涡30 s，同法吹干、溶解、测定。将提取后测得的峰面积与未提取测得的峰面积进行比较，计算提取回收率。结果见表2。

表2 方法回收率和提取回收率试验结果(±s，n=6)

表2 方法回收率和提取回收率试验结果(±s，n=6)

质量浓度(μg/mL)0.10 1.60 5.00测定质量浓度(μg/mL)0.10 ±0.006 1.62 ±0.07 4.97 ±0.19方法回收率(%)104.50 ± 6.28 101.03 ± 4.63 99.37 ± 3.82提取回收率(%)80.48 ± 4.63 90.30 ± 4.63 91.25 ± 3.91

血浆样品稳定性:用空白血浆配制足够量的质量浓度为0.10，1.60，5.00 μg/mL 的莫西沙星样品，立即按 2.3 项下方法处理、测定。在－20℃冰箱中冷冻24 h后取出，室温解冻后，各取样0.5 mL处理、测定。剩余血浆样品再次放入－20℃冰箱中冷冻，24 h后解冻、处理、测定，重复冻融循环3次，考察血浆样品冻融稳定性。结果低、中、高质量浓度的 RSD 分别为 5.27%，4.03%，5.25% ，显示冻融条件对血浆样品的检测结果无明显影响。用空白血浆配制足量的质量浓度为 0.10，1.60，5.00 μg/mL 的莫西沙星样品，吸取各质量浓度样品1 mL，置1.5 mL离心管中，每个质量浓度9份。其中5 份在室温下放置 0，2，4，8，12 h 后按 2.3 项下方法处理、测定;另外4份分别在－20℃冰箱中保存1，2，4，12周后，再按2.3项下方法处理、测定。3个质量浓度室温下测定结果的 RSD为4.18% ～5.77%，冷冻条件下测定结果的 RSD为4.58% ～8.15%，表明莫西沙星血浆样品在室温放置8 h和－20℃冷冻条件下均有很好的稳定性。

2.5 样品分析

健康受试者(2周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物)于早晨空腹以200 mL温水送服单剂量莫西沙星400 mg，于服药后1，3，24 h抽取静脉血5 mL共3份，按拟订的方法进行处理和测定。结果3 份样品的血药浓度分别为 2.60，1.82，0.48 μg/mL，表明建立的方法可用于实际药物浓度的测定。

3 讨论

喹诺酮类药物是以4－喹诺酮(或称为吡酮酸)为基本结构的人工合成药物，在 N1，C3，C6，C7，C8位引入不同基团而形成不同药物，同时也导致其理化性质、抗菌活性有所差异，化学结构的相似性也为该类药物的同时分离提供了可能[1]。由于结构中含有羧基以及可质子化的氮原子，喹诺酮类药物均具有两性化合物的特性，色谱行为受流动相pH的影响较大。利用液相色谱进行分离时，碱性基团会与固定相未封闭的残余硅醇基之间发生相互作用，导致分离时间延长，发生拖尾现象。碱性越强，拖尾现象越严重，如采用Hypersil C18柱分离受试的几种喹诺酮类药物时，莫西沙星保留时间最长，拖尾现象最严重，灵敏度无法满足测定要求，调节pH、添加扫尾剂也未得到明显改善。将分析柱调整为C8柱后，莫西沙星峰形明显改善、灵敏度增高、保留时间适中，因此本试验中选用C8柱作为分离柱。

作为酸碱两性化合物，喹诺酮类药物在水溶液中可以多种离子形式存在，需对流动相的pH进行调节。筛选试验结果表明，pH为3.0～4.0时对大多数药物较合适，低pH流动相也可抑制硅醇的离解，有利于改善峰形;加入三乙胺可进一步改善峰形，对其使用浓度进行筛选后选用1%三乙胺。综合考虑灵敏度、保留时间和选择性，最终选择以磷酸缓冲盐、甲醇、乙腈为流动相，以三乙胺作为扫尾剂调节峰形和灵敏度。在实际检测时，可以根据分析的品种对流动相比例进行微调，以使分离效果最佳化。由于含有的取代基团不一样，受试的几种药物最大吸收波长并不一致，在进行实际样品分析时，可根据具体分析品种选择合适的检测波长，以进一步提高检测灵敏度。

试验表明，采用常用的几种蛋白沉淀试剂直接沉淀蛋白时，干扰物较多，且灵敏度较差。在一定pH条件下，以二氯甲烷提取后可消除大部分内源性干扰物质。在测定莫西沙星时，采用0.5 mol/L的氢氧化钠10 μL以调节萃取液酸碱度，可明显提高莫西沙星的萃取效率。样品测定结果表明，建立的高效液相色－紫外分光光度法可用于人体血样浓度的测定。

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