HPLC梯度洗脱法同时测定复方盐酸喹那普利/氢氯噻嗪片剂含量及有关物质

吕灵云， 操 锋， 肖衍宇， 平其能

(中国药科大学药剂学教研室，江苏 南京 210009)

复方盐酸喹那普利/氢氯噻嗪片剂(商品名:Accuretic)是辉瑞公司于1999年上市的高血压和充血性心力衰竭治疗药物，主要成分是盐酸喹那普利和氢氯噻嗪。其中，盐酸喹那普利(QHCl)为无巯基、长效、口服血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，是第3代ACEI的优秀代表之一［1］;氢氯噻嗪(HCTZ)是临床常用利尿药，常与其他降压药合用治疗高血压。HCTZ和QHCl合用，可增强ACEI的作用。

与其他ACEI类药物一样，QHCl存在稳定性问题，其降解途径为:1)分子内仲胺去质子化后进攻羰基成环，形成2，5-二酮哌嗪(DKP);2)侧链酯基水解形成喹那普利拉。据文献报道，QHCl对湿度、pH和温度敏感，其环化和水解均与环境pH有关，即在低pH条件下，主要生成DKP;在较高pH条件下，主要生成喹那普利拉［2-5］。HCTZ的有关物质4-氨基-6-氯-1，3-苯二磺酰胺(以下简称二磺酰胺)既是HCTZ合成过程的中间体，也是其降解产物［6］。

美国药典32版(USP32)推荐采用HPLC法同时测定QHCl及其两个有关物质，也有文献报道采用HPLC法测定QHCl或同时检测QHCl和喹那普利拉［7-8］。中国药典2010年版二部则规定分别采用非水滴定法及紫外分光光度法测定HCTZ原料及制剂含量，而采用比色法进行有关物质二磺酰胺限度检查，还有文献采用HPLC法测定HCTZ及其有关物质［9］。Gandhimathi等［10］报道采用 HPLC 法同时测定复方QHCl/HCTZ片剂中两个主要成分的含量，另有报道用LC-MS法同时测定人血浆中HCTZ、QHCl和喹那普利拉［11］。目前国内外尚未见有同时检测复方QHCl/HCTZ片剂中QHCl、喹那普利拉、DKP、HCTZ及二磺酰胺等5种化合物的报道，本文采用HPLC梯度洗脱法实现了这5种化合物的良好分离和测定，为该复方片剂的质量控制提供了一种有效的分析方法。

1 仪器与试药

Agilent 8453紫外扫描仪;Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括G1312A型二元泵、G1313A型自动进样器、G1314A型紫外检测器和AT-103柱温箱;BS124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);KQ-100型台式超声仪(昆山市超声仪器有限公司);PB-10型pH计(Sartorius公司)。

HCTZ对照品(纯度99.8%，中国药品生物制品检定所，批号100309-200702，用前于105℃烘箱中放置4 h);QHCl对照品(纯度98.3%，中国药品生物制品检定所，批号100568-200401);复方QHCl/HCTZ片剂样品(自制，规格:10.8/12.5 mg，批号:20110405、20110406、20110408);水为纯净水，乙腈为色谱纯，三乙胺和磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相A:0.05%三乙胺水溶液(用10%磷酸调pH至3.50)，流动相B:乙腈，按表1中程序进行线性梯度洗脱;柱温:40℃;检测波长:215 nm;进样量:20 μL。在该色谱条件下，5种化合物的相邻各峰间分离度均大于1.5;理论塔板数按QHCl峰计算大于20000，按HCTZ峰计算大于4000。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Procedure of gradient elution

2.2 对照品溶液配制

QHCl对照品溶液:取QHCl对照品6 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，加水，超声波处理使溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

HCTZ对照品溶液:取 HCTZ对照品12.5 mg，精密称定，置500 mL容量瓶中，加水，超声波处理使溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液配制

取样品10片，研细，取适量(约相当于 QHCl 10.8 mg，HCTZ 12.5 mg)，精密称定，置 100 mL 容量瓶中，加水适量，超声波处理20 min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为贮备液;精密吸取贮备液2.0 mL至10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法专属性考察

按处方比例称取空白辅料，置100 mL容量瓶中，加水适量，超声波处理15 min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液和空白溶剂水进样，记录色谱图(见图1A)。

称取QHCl对照品适量，于60℃烘箱中放置10 d，用水配制成30 mg·L-1溶液，进样，记录色谱图(见图1B)。称取QHCl对照品适量，用水配制成50 mg·L-1溶液50 mL，共3份;取2份分别加入浓度均为0.1 mol·L-1的盐酸和氢氧化钠1 mL，室温放置24 h，再分别加入同浓度氢氧化钠及盐酸中和;另取1份于(4500±500)lx光照度下放置24 h。称取QHCl对照品适量，用3%双氧水配制成50 mg·L-1溶液，室温放置24 h。取以上分别经酸、碱、光照、氧化处理的QHCl对照品溶液，加水稀释1倍，进样，记录色谱图(见图1B～C)。

HCTZ对照品的酸、碱、光照、氧化及高温破坏实验同上操作，色谱图见图1D。

图1 方法专属性实验色谱图Figure 1 Chromatograms of specificity test

由图1可见，辅料对样品测定无干扰;QHCl与其酸、碱、光照、氧化及高温降解产物均能很好分离，其中酸、碱对QHCl的破坏作用明显，降解产物明显增多;HCTZ经破坏试验产生的降解产物仍主要为二磺酰胺，与HCTZ分离良好，未检测到其他降解产物。

2.5 线性关系考察

取QHCl对照品17.7 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得QHCl贮备液(70.8 mg·L-1);另取HCTZ对照品37.9 mg，精密称定，置500 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得HCTZ贮备液(75.8 mg·L-1)。精密量取 QHCl贮备液 0.1、1、3、5、7、9 mL 各置编号为1、2、3、4、5、6 的 10 mL 容量瓶中，再精密量取HCTZ 贮备液 9、7、5、3、1、0.1 mL 依次加入上述编号为1～6的各容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制得QHCl和HCTZ的系列混合标准溶液，进样，记录色谱图。以峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归，分别得 QHCl回归方程:A=24.785C-6.376，r=0.9998;HCTZ回归方程:A=94.291C+28.761，r=0.9999。结果表明，QHCl和 HCTZ分别在0.708 ～63.72 mg·L-1和0.758 ～68.22 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度实验

分别取“2.5”项下制备的编号分别为1、3、6号的低、中、高3个质量浓度混合标准溶液，于日内每隔2 h进样测定1次，连续5次;另于每日进样测定1次(当天配制)，连续5次，记录色谱图。结果显示，3个质量浓度的混合标准溶液所测 QHCl和HCTZ峰面积的日内及日间RSD均在0.7%～2.1%范围内(n=5)，说明方法精密度良好。

2.7 回收率实验

精密称取HCTZ 对照品10、12.5、15 mg，分别置500 mL容量瓶中，加入水，超声波处理至充分溶解，冷却，定容，制得 19.80、25.20、30.40 mg·L-1的低、中、高质量浓度HCTZ溶液;再精密称取QHCl对照品 8.68、10.85、13.02 mg，分别置 500 mL 容量瓶中，加入水，超声波处理至充分溶解，冷却，定容，制得 17.40、21.60、25.80 mg·L-1的低、中、高质量浓度QHCl溶液。按处方比例称取辅料置100 mL容量瓶中，共9份，将以上低、中、高3个质量浓度的HCTZ和QHCl对照品溶液分别加入含辅料容量瓶中，每个质量浓度各3份，超声波处理15 min，用相应对照品溶液定容，混匀，滤过，取续滤液进样，记录色谱图。将峰面积代入回归方程，计算回收率(见表2、3)。

由表2、3可见，QHCl和HCTZ的平均回收率均在98% ～102%之间，RSD均小于2%。

2.8 稳定性实验

按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8 h 进样，记录色谱图。结果显示，在不同时间点所测QHCl和HCTZ峰面积的RSD分别为1.66%和0.96%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

表2 HCTZ回收率实验结果(n=3)Table 2 Results of HCTZ recovery test

表3 QHCl回收率实验结果(n=3)Table 3 Results of QHCl recovery test

2.9 样品测定

分别按“2.2”及“2.3”项下方法制备 QHCl和HCTZ对照品溶液及3批次样品的供试品溶液，进样，记录色谱图。按外标法测定样品中两主成分含量(以百分标示量计)，采用主成分1%自身对照法测定有关物质(供试品溶液稀释100倍后的色谱图见图2)，每批次样品测定3次，结果见表4。

图2 稀释100倍的供试品溶液色谱图Figure 2 Chromatogram of 100-fold diluted sample solution

表4 样品测定结果(n=3)Table 4 Determining results of samples

3 讨论

3.1 检测波长的选择

按“2.2”项下方法分别配制QHCl和HCTZ对照品溶液，并稀释1倍，以水为空白溶剂，在200～400 nm波长范围内扫描，结果显示，HCTZ在214、271和317 nm处有吸收峰，QHCl在215 nm处有末端吸收。故选择两药均有较大吸收的波长215 nm为检测波长。

3.2 有关物质的确定

USP32中明确指出，QHCl有两个相关物质，即喹那普利拉和DKP。且QHCl的降解行为与介质pH密切相关，即在高pH条件下，QHCl主要降解为喹那普利拉，而在低pH条件下，QHCl主要降解为DKP。由这两个有关物质的结构可知，喹那普利拉的极性大于DKP。本文中QHCl破坏性实验也显示，在碱破坏实验色谱图中，5.7 min处有一个明显的有关物质峰，而在酸破坏实验色谱图中，12.5 min处则出现另一个明显的有关物质峰，且在QHCl破坏性实验色谱图中未发现其他有关物质峰。据此推定，色谱图中5.7和12.5 min处的有关物质峰应分别出自喹那普利拉和DKP，且极性较大的喹那普利拉先出峰，DKP最后出峰，这与文献［4］报道相一致。

由HCTZ破坏性实验色谱图可见，在3.8 min处均只有一个相关物质峰，无其他相关物质峰，且在酸、碱破坏实验色谱图中该峰更为明显。此外，在相同色谱条件下，对相同质量浓度的HCTZ对照品溶液进样分析，也发现在3.8 min处出峰。据此推定，色谱图中3.8 min处的有关物质峰即为二磺酰胺峰。

3.3 流动相的选择

在预实验中，曾选择不同的流动相系统对复方QHCl/HCTZ片剂进行色谱分析，结果发现，与甲醇相比，乙腈用作流动相可致色谱基线平稳，洗脱力强，主成分峰形对称性好，理论塔板数高;在反相HPLC系统中，由于HCTZ和二磺酰胺的极性较强，保留时间短，不易分开，而QHCl与DKP的极性弱，出峰较迟，因此，流动相中乙腈的比例直接影响到HCTZ与二磺酰胺的分离度，也影响到QHCl与DKP的出峰时间;而且，采用HPLC等度洗脱法，虽然可将5种化合物较好分离，但由于化合物间极性差异大，导致分析时间过长。所以，本文采用乙腈-水梯度洗脱方式对该复方片剂进行HPLC分析，即在HCTZ与二磺酰胺分离后，调整流动相中乙腈比例，提高流速，致使QHCl及其有关物质较快出峰，这样，既使5种化合物得到很好分离，又缩短了分析时间。

3.4 流动相pH的选择

在色谱分析时，QHCl及其两种有关物质的出峰时间对流动相pH敏感，尤其是喹那普利拉，即随着流动相pH值的增加，三者的出峰时间均会提前，若pH值过高，则喹那普利拉与HCTZ将无法分开，而若pH值减小，三者的出峰时间则会延迟。综合考虑5种化合物的有效分离、分析时间及一般常用C18柱的pH适用范围，最终选定流动相pH为3.50。

3.5 梯度峰分析

由图1A可见，空白辅料和溶剂进样后，均出现梯度峰。究其原因，推测可能是由于流动相中乙腈的弱极性杂质所致，即梯度洗脱开始时，流动相极性较强，此杂质不能被洗脱，并在柱头富集，而随着流动相中有机相比例提高，其极性降低，杂质被洗脱，故在分析后期出现梯度峰。

综上所述，本文所建立的HPLC梯度洗脱法简便快速、专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于复方QHCl/HCTZ片剂的含量测定和杂质检查。

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