异钩藤碱对脂多糖诱导的星形胶质细胞炎性介质释放的抑制作用

宋 宇，刘继平，石富国，兰 洲，厉璐帆，马世平

中国药科大学中药药理教研室

各种脑血管病变引起的中枢缺血性疾病是现代社会危害中老年人健康的重要疾病，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点。因此探索脑缺血的病理机制及寻找有效的治疗药物具有重要的学术价值和社会意义。星形胶质细胞作为中枢神经系统的免疫吞噬细胞，在脑缺血及缺血再灌注后，被各种致炎因素激活成反应性星形胶质细胞。激活的星形胶质细胞释放多种炎性介质，如白介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukine-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）及前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）等[1]。 这些炎症介质可以进一步激活周围的胶质细胞，导致突触消失，神经元凋亡或坏死，形成二次损伤[2]。因此抑制星形胶质细胞过度的激活和炎性介质的大量释放有助于保护神经元，在脑缺血治疗中具有重要意义。

钩藤是茜草科植物钩藤（Uncaria rhynchophylla Jacks)及其同属植物的带钩茎枝,有清热平肝、息风定惊的功效，临床用于治疗癫痫、惊厥和高血压等病[3]。目前已从钩藤中分离出30多种化合物，异钩藤碱(isorhynchophylline，IRN，图 1)是其中的一种具有多种药理活性的成分，早期的研究主要集中于异钩藤碱的降压、抗心律失常作用[4-5]。近年来，钩藤提取物和异钩藤碱都显示出抗中枢缺血再灌注损伤作用，很多研究指出，异钩藤碱可以降低兴奋性神经递质谷氨酸诱导的神经元凋亡和损伤。进一步研究还表明，异钩藤碱可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小胶质细胞的激活和炎性因子的释放[6]。然而异钩藤碱对于激活的星形胶质细胞的作用目前还不清楚。

本实验用LPS刺激星形胶质细胞模拟脑内炎性环境，观察不同浓度的异钩藤碱对IL-1β和TNF-α释放的抑制作用，以及异钩藤碱对iNOS mRNA表达水平的影响，初步探索异钩藤碱发挥抗炎作用的分子机制。

图1 异钩藤碱的结构式

1 材 料

1.1 试剂

异钩藤碱（广西中医药研究所，纯度:97.8%）；DMEM 培养基干粉（Gibco，批号:31800-014）；小牛血清(Gibco，批号:16010-159)；注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素 (山东鲁抗辰欣药业有限公司)；胰蛋白酶（1:250）（Typsin，南京大治生物技术有限公司）；一抗:大鼠抗人胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(GFAP，武汉博士德生物工程有限公司)；一氧化氮测试试剂盒 （南京建成生物工程研究所）；IL-1β和TNF-α 的 ELISA 试剂盒（Santa Cruz）。

1.2 仪器

CO2培养箱 （TEHER）、倒置显微镜 （PM-6 Olympus）；Mini-REPOTEAN 电 泳槽 （Bio-Red 公司）；TGL-16G高速冷冻离心机 （日本日立公司）；DYY-Ⅲ型电转移槽（北京六一仪器厂）；Biocell2010酶标仪（Anthos Labtec Instruments公司）。

1.3 动物

新生1天的Sprague Dawley大鼠 （上海西普尔-必凯实验动物有限公司），许可证号:SCXZ（沪）2008-0016。

2 方法与结果

2.1 新生大鼠脑皮质星形胶质细胞的分离、培养与纯度鉴定

根据参考文献[7],在无菌条件下取新生SD鼠大脑皮质，去除血污，仔细剥除脑膜和血管，然后将其剪碎成小块（＜1 mm3），加入0.125%的胰酶消化15 min，并轻轻吹打制成单细胞悬液。移入离心管，加入适量的含20%血清的DMEM培养基中止消化。200目筛网过滤，1000 r·min-1离心 8 min，吸弃上层，然后加入适量含20%血清的DMEM培养基，制成单细胞悬液，调整细胞密度至 2×105·mL-1，并将其接种至玻璃培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min；翻转培养瓶吸出瓶中的细胞悬液，放入另一个培养瓶内，同法，再差速贴壁一次，将滤液接种至塑料培养瓶中，接种密度约1×105·mL-1。次日换液，去除未贴壁的活力差及死亡细胞，继续培养9～12d，培养液颜色略变黄时换液，每次换液稍加振摇,12d开始每4d传一代，共传三次，每次传代均差速贴壁0.5h。

将传至4代的星形胶质细胞按照1×105·mL-1接种至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，放入培养箱中培养2～3d后,取出盖玻片，进行GFAP免疫组化鉴定，结果表明本实验所使用星形胶质细胞纯度＞95%。

2.2 实验分组、药物处理及数据分析

待细胞长至80%融合度时，以1×105密度接种于96孔板或6孔板。细胞培养48h后，吸去原培养液，用无糖Earle’s液清洗1遍，同时加入含有LPS或含有LPS与异钩藤碱的无糖培养基进行处理，细胞处理后分为空白组；LPS（1μg·mL-1）处理模型组；LPS+IRN 3μg·mL-1组；LPS+IRN 10μg·mL-1组；LPS+IRN 30μg·mL-1组。 孵育 24 h。 吸取细胞培养上清液并收集细胞，用于实验检测。

2.3 IRN对细胞活力的影响

将分组培养处理后的96孔板，加入20μL的MTT(5 g·L-1)37℃继续孵育 4 h，弃去上清液，每孔加入150μL二甲亚砜，振荡10 min，以波长520 nm于酶标仪上测吸光度值。以空白对照组吸光度值均数为100%，计算细胞存活率。各孔细胞存活率(%)=（各组吸光度值/空白组吸光度值均数）×100%。

如表1所示，与空白对照组相比，LPS刺激并未明显的改变星形胶质细胞的活力，异钩藤碱不同浓度单独处理或与LPS共同孵育都未能明显的改变星形胶质细胞的活力。

表1 IRN对星形胶质细胞活力的影响（，n＝6）

表1 IRN对星形胶质细胞活力的影响（，n＝6）

2.4 细胞培养上清液中NO含量的测定

药物处理后，收集细胞上清液，1500 r·min-1，4℃离心10 min。根据Griess法测定培养液中NO的含量[8]。具体测定方法按试剂盒说明书进行操作。

与空白对照组相比，LPS刺激显著地升高了星形胶质细胞培养基中NO的含量，如表2所示，IRN可以剂量依赖地降低培养基中NO的水平，与LPS组相比，IRN 30μg·mL-1孵育可以显著地降低星形胶质细胞的炎性介质NO释放。

表2 IRN对LPS诱导星形胶质细胞NO释放的抑制作用（，n＝6）

表2 IRN对LPS诱导星形胶质细胞NO释放的抑制作用（，n＝6）

注:##p＜0.01 vs空白组，*p＜0.05 vs LPS 组

2.5 PCR检测星形胶质细胞中iNOS mRNA的含量

药物处理后，用PBS洗涤细胞，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA。然后采用随机引物,参照逆转录酶MMLV说明书方法进行逆转录，取逆转录产物进行PCR。引物核苷酸序列分别为iNOS引物序列:sense，5’-AGAGAGATCCGGTTCACA-3’；antisense，5’-CAC AGA ACT GAG GGT ACA-3’(GenBank accession number S71597)。 GADPH 引物序列 sense，5’-GAAGGG TGGGGCCAAAAG-3’； antisense， 5’-GGATGCAGGGAT GATGTTCT-3’ (Gen Bankaccession number AB017801)。将PCR产物电泳，用紫外凝胶成像系统照相，并用Kodak Digital Science 1D分析软件进行灰度扫描和分析。

如图2与表3所示，RT-PCR结果表明空白组基本观察不到iNOS mRNA表达，而LPS刺激显著地诱导了iNOS mRNA的表达。不同浓度的IRN处理呈剂量依赖性的抑制了LPS诱导的iNOS mRNA表达。

图2 IRN对iNOS mRNA表达水平的影响

表3 IRN 抑制 iNOS mRNA 表达水平（，n＝6）

表3 IRN 抑制 iNOS mRNA 表达水平（，n＝6）

##p＜0.01 vs空白组；**p＜0.01,*p＜0.05 vs LPS 组

2.6 ELISA法测定细胞上清液中的IL-1β和TNF-α含量

药物处理24 h后收集细胞培养上清液。分别按ELISA试剂盒说明书绘制标准曲线和测定培养上清液中的IL-1β和TNF-α含量水平。

结果如表4所示，LPS组IL-1β和TNF-α的水平都远高于空白对照组，而IRN不同浓度组都明显的降低了这两种炎性因子的含量。

表4 IRN 对 IL-1β 和 TNF-α 释放含量的影响（，n＝6）

表4 IRN 对 IL-1β 和 TNF-α 释放含量的影响（，n＝6）

##p＜0.01 vs空白组,*p＜0.05 vs LPS组

3 讨 论

大量研究表明，星形胶质细胞在脑缺血疾病中扮演着重要角色，在缺血及再灌注后，缺血灶周围大量的星形胶质细胞被激活，激活的星形胶质细胞一方面分泌出神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和胶质源性神经生长因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）， 促进受损的神经元的修复与再生[8]。另一方面，激活的胶质细胞在缺血再灌注的初期不但参与抗原递承，启动炎性过程，还分泌了大量的炎性介质，例如NO、PGE2、IL-1β和 TNF-α等， 这些炎性介质进一步激活了周围的胶质细胞，加重了脑内的炎症反应，形成缺血后的二次损伤[2]。

NO对细胞的作用具有两面性，中枢神经系统在一氧化氮合酶(NOS)作用下通过左旋精氨酸-NO途径产生NO。NOS同工酶有3种亚型，即神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)以及诱导型(iNOS)。生理状态下，由eNOS和nNOS产生的少量NO可灭活氧自由基，并调节脑血流。在脑缺血再灌注过程中，脑内产生的多种炎性介质均可激活星形胶质细胞iNOS，释放大量的NO，导致神经元去极化和谷氨酸盐释放增加，继而产生神经兴奋性中毒，造成神经元损伤或诱导神经元凋亡[9]。异钩藤碱可以有效地降低LPS激活的星形胶质细胞中iNOS mRNA的表达，从而明显地减少了NO的合成和释放，降低缺血再灌注后的二次损伤。IL-1β和TNF-α具有更广泛的生理病理作用，IL-1β是触发免疫和炎症反应的重要介质，诱导细胞粘附分子表达，吸引中性粒细胞聚集，激活胶质细胞产生多种细胞因子，诱导炎性细胞因子的基因表达及分泌，促进神经毒性物质的产生和释放，IL-1β可诱导及加快凋亡基因表达[10]。TNF-α可以刺激胶质细胞产生多种炎症因子，并调控多种细胞的细胞周期和细胞功能；直接或间接的引起神经元损伤或死亡[11]。异钩藤碱对LPS刺激的星形胶质细胞的IL-1β和TNF-α分泌显示出强大的抑制作用，有效地减轻了缺血后胶质细胞激活介导的炎症反应的进一步加重，从而有利于神经元的存活和再生。

本研究表明，异钩藤碱可以显著地抑制LPS刺激的星形胶质细胞炎性介质NO的释放，降低iNOS mRNA的表达水平，同时减少致炎因子IL-1β和TNF-α的产生。已有研究证明，异钩藤碱还能有效地抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活和炎性因子的释放。这些结果说明异钩藤碱具有较好地抑制中枢炎症反应的作用，为传统中药钩藤作为治疗缺血性脑病药物提供了科学依据。

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