HPLC法测定不同煎剂中钩藤碱和异钩藤碱煎出效率

卓韦杰，侯拥铓，丁 悦，阿娜尔，付 磊，张语含，窦志榕，王 柳，孙 瑶，虞 梅

(乌鲁木齐市中医院南门医院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000)

钩藤，性甘凉，归肝、心包经[1]。具有息风定惊，清热平肝的功效。目前，临床对于钩藤饮片的应用主要为由高血压引起的风眩以及神经性头痛，是一味常用的中药材。多见于配方使用，单味药也可做茶饮[2]。钩藤与它药配伍成方后能够增强息风止痉的作用从而发挥更好的疗效，故临床应用单味药较少见，常见于方剂天麻钩藤饮或半夏钩藤汤中使用。2020年版《中国药典》中明确规定，钩藤入煎剂时应当“后下”煎煮，不可与它药同煎太久或久煎[3]。现代药理学研究证明钩藤主要有效成分钩藤碱与异钩藤碱结构不稳定，久煎易被破环[6]。需要后下煎煮保证其有效成分能够最大煎出并保留[4]。因此本文挑选了两种临床最常用的方剂(天麻钩藤汤、半夏白术钩藤饮)[5]进行钩藤碱和异钩藤碱的煎出效率研究，实验结果报告如下。

1 实验仪器及试药

1.1 实验仪器

美国Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪；电子分析天平(英衡C型号，浙江英衡实验仪器有限公司)；超声波提取器(CR-040S型，深圳春霖实验仪器有限公司)。

1.2 实验用药

钩藤碱标准品(四川省维克奇生物科技有限公司；批号：wkq20060810 CAS：76-66-4)，异钩藤碱标准品(四川省维克奇生物科技有限公司；批号：wkq21022607 CAS：6859-01-4)。分析纯甲醇、色谱纯甲醇、三乙胺水溶液。所有实验用水均为灭菌注射用水，天麻钩藤饮与半夏白术钩藤方剂原药材饮片(所有原药材饮片均由乌鲁木齐市中医院药学部鉴定合格)。

2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相：甲醇(色谱纯)-水=68∶32(含0.2%三乙胺水溶液，冰乙酸调pH=7.0)，流速为0.8mL/min，检测波长254nm，柱温30℃。

3 实验方法

3.1 对照品溶液的制备

精密称定钩藤碱对照品11.2mg、异钩藤碱标准品3.2mg，分别置于两只10mL的棕色容量瓶中，加入75%的分析纯甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，即得1.12mg/mL钩藤碱标准品储备液与0.32mg/mL得异钩藤碱标准品储备液，放置于低温2～6℃下冷藏避光保存。

3.2 供试品溶液的制备

将称取好的药材用纱布包裹后加入5倍量水进行煎煮，至方中其他药沸腾时将钩藤后下煎煮，后下煎煮5分钟时取为第一组，10分钟时为第二组，此后每分钟取为一组直至15分钟。每种方剂共计7组。取得的煎剂经过滤补足后，取10mL用75%甲醇溶液定容至25mL容量瓶，常温条件下超声(功率300W)提取40min后用75%甲醇溶液再定容至刻度线，滤过后取续滤液，即得。

3.3 模型制剂的制备

模拟日常药房调剂，按处方称取天麻钩藤饮与半夏白术钩藤汤方组中各药材7日用量，钩藤单独称取，阴凉干燥环境下保存备用。

3.4 阴性模型的制备

按照上述方法称取天麻钩藤饮与半夏白术钩藤汤方剂中各药材饮片一日用量，不称取钩藤饮片，阴凉干燥环境下保存备用。

3.5 线性关系与系统专属性的考察

精密吸取前文所述的配置完成的对照品溶液各2mL，均匀混合，得到钩藤碱及异钩藤碱对照品储备液。按照0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL精密吸取6组储备液，用75%甲醇稀释定容至5mL即得。分别吸取上述6组稀释液高效液相进样10μL，色谱条件遵循色谱条件中规定的各项指标，测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行线性回归，得出线性回归方程Y钩藤碱=0.9947X+4.2085(r2=0.9997)，证明钩藤碱在0.0021～0.05mg范围内有良好的线性关系。Y异钩藤碱=0.9897X+0.2217(r2=0.9998)，证明异钩藤碱在0.0023～0.0872mg范围内有良好的线性关系。专属性考察部分见图1，混合标准品溶液、两种方剂煎剂溶液的高效液相色谱图证明峰形良好，两种阴性模型煎剂高效液相色谱图则说明在无钩藤时，钩藤碱及异钩藤碱出峰处无其它杂质峰干扰结果，说明该色谱条件对两种钩藤碱的专属性好，异钩藤碱与钩藤碱分离度均≥1.5，说明该色谱条件下得出的结果真实可靠。

4 方法学考察

4.1 精密度测定

精密吸取混合标准品储备液10μL，按照色谱条件高效液相连续进样6次，测定峰面积。计算RSD值为1.13%。

4.2 稳定性测定

取各供试品溶液在0h、2h、3h、4h、5h、6h分别测定钩藤碱与异钩藤碱峰面积，计算RSD值。天麻钩藤饮中RSD钩藤碱=2.11%，RSD异钩藤碱=2.14%。半夏白术钩藤汤中RSD钩藤碱=2.71%，RSD异钩藤碱=2.54%说明两种方剂的供试品溶液在6h内均稳定。

4.3 含量测定

选取上文所述(3.2供试品溶液的配置)的各组配置完成的供试品溶液，按照色谱条件精密吸取10μL按照HPLC法进样，通过峰面积与所得出的标准曲线方程(3.5线性关系与系统专属性考察)计算两种方剂中各不同时间的组份中钩藤碱与异钩藤碱含量。结果见图2天麻钩藤饮煎出效率时间规律图、图3半夏白术钩藤汤煎出效率时间规律图。

图2 天麻钩藤饮煎出效率时间规律图

图3 半夏白术钩藤汤煎出效率时间规律图

5 结果与讨论

根据图2天麻钩藤饮煎出效率时间规律图、图3半夏白术钩藤汤煎出效率时间规律图。可以明显看出，天麻钩藤饮与半夏白术钩藤汤在对钩藤后下煎煮时，最佳煎煮时间并不一致，天麻钩藤饮中钩藤在11分钟时，其中的钩藤碱与异钩藤碱的煎出效率最高，在之后开始下降，而在半夏天麻钩藤饮中，钩藤碱与异钩藤碱的煎出效率在13分钟时达到了最高，之后开始下降。这说明不同的方剂中，钩藤饮片的煎煮时间并不一致。应当具体方剂具体对待，使中药材钩藤在临床上获得更好的疗效。

在HPLC法对钩藤碱和异钩藤碱的考察中，曾经考察了以纯水与甲醇的流动相适用性，分别考察了甲醇∶水=(67∶33、70∶30、65∶35、55∶45)，最终发现在68∶32时为钩藤碱与异钩藤碱的最小分离阈值，小于此比例者均未有效分离。即使如此，纯水与甲醇流动相对于钩藤碱与异钩藤碱的分离度仍然小于1.5。因此，三乙胺水溶液在分离钩藤碱与异钩藤碱时至关重要，能够有效分离二者的同时有效改善拖尾，使色谱条件稳定。而纯水甲醇流动相不稳定，且易出现拖尾，粘连的现象。

本次实验以两种不同方组的方剂入手，具体以异钩藤碱与钩藤碱的煎出效率作为指标，得出了两种不同的方剂的最佳煎煮时间。其中天麻钩藤饮在钩藤后下煎煮11分钟时钩藤碱与异钩藤碱的煎出效率最高，半夏白术钩藤汤中，钩藤的最佳后下煎煮时间则为13分钟，对临床合理煎药提供了参考。