复方参芪五味咀嚼片微生物限度检查的方法验证

何 进，史国兵，高 军，杨晓东(.沈阳军区总医院药剂科，辽宁 沈阳 0840;.大连医科大学临床药学，辽宁 大连 607)

复方参芪五味咀嚼片是在原生脉饮的基础上，增加黄芪制成的新型中药复方口服制剂 ，由黄芪、人参、五味子、麦冬等中药材组成，具有提高机体免疫力，抗疲劳等功效。按照中国药典(2010年版)一部附录相关要求，要进行微生物限度检查。笔者主要对复方参芪五味咀嚼片的细菌、霉菌及酵母菌计数方法，及控制菌大肠埃希菌的检查方法进行验证，以建立适合于该制剂的微生物限度检查方法，为制剂进一步开发提供依据。

1 实验材料

1.1 药品和培养基 复方参芪五味咀嚼片(沈阳军区总医院，批号 090925，091029，091030);0.9%氯化钠注射液(沈阳军区总医院，2008022207)。营养琼脂培养基(批号070104);营养肉汤培养基(批号071008);玫瑰红钠琼脂培养基(批号080216);改良马丁琼脂培养基(批号070426);胆盐乳糖(BL)培养基(批号070517);4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(批号070604);蛋白胨(批号070712);均购自北京三药科技开发公司。

1.2 菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(B)98001］和黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(B)98003］，均为第3代菌株，购自辽宁省药检所。

1.3 仪器 ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂);NC303-4A电热恒温培养箱和NC303-4电热恒温培养箱(南京长江仪器厂);YX280B手提式不锈钢消毒器(上海三申医疗器械有限公司)。

2 方法和结果

2.1 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的制备 取磷酸二氢钾 3.56 g、磷酸氢二钠 7.23 g、氯化钠 4.30 g、蛋白胨 1.0 g，加水 1 000 ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

2.2 供试液的制备 取复方参芪五味咀嚼片10 g，置灭菌乳钵研成粉末，加适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液研匀并转移到灭菌烧瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，在45℃恒温水浴中保温震荡混匀，制成1∶10倍的供试液。

2.3 菌液制备 分别取经35℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的新鲜培养物，以及经25℃培养48 h的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释成每1 ml含菌数50～100 cfu的菌悬液;取经25℃培养5 d的黑曲霉新鲜培养物，用5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释成每1 ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。以上各菌悬液或孢子悬液同时各取2份注入琼脂培养基培养，采用平皿计数法计数，结果见表1。

2.4 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.4.1 验证方法与结果 ①试验组:采用平皿法，取1:10供试液及50～100 cfu/ml/试验菌各1 ml，依次加入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基20 ml，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，按规定温度培养48～72 h，按菌落计数方法测定其菌数，进行3次的独立平行试验，并分别计算试验组和稀释剂对照组的菌回收率。依据《中华人民共和国药典》2010年版一部附录微生物限度检查方法进行判定。结果见表2。②菌液组:测定所加的试验菌数。③供试品对照组:取规定量1:10供试液，按菌落计数方法测定样品本底菌数。结果均未见菌生长。④稀释剂对照组:取稀释液10 ml，同试验组方法测定菌数。结果5种试验菌回收率均大于70%。

表2 细菌、霉菌和酵母菌计数方法回收率结果(%，n=3)

2.4.2 样品细菌、霉菌或酵母菌计数检查 取3批样品各10 g，分别用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml制成1:10的供试液。取1∶10供试液10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶100的供试液。再取1∶100供试液10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠(蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶1 000的供试液。取3批样品各稀释级供试液各1 ml分别注入无菌平皿中，然后倾入20 ml冷至45℃的营养琼脂培养基(细菌计数)，另取1∶10和1∶100供试液各1 ml分别置无菌平皿中，倾入20 ml冷至45℃的玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌、酵母菌计数)，混匀，凝固后倒置于特定温度的培养箱中培养(营养琼脂培养基的培养温度为35℃，培养时间为48 h;玫瑰红钠琼脂培养基的培养温度为25℃，培养时间为72 h)。每个稀释级的供试液平行作2份;另取稀释液1 ml作阴性对照。结果表明，3批样品按验证方法检查，细菌、霉菌或酵母菌总数均＜10 cfu/ml，均符合规定。

2.5 控制菌检查方法的验证

2.5.1 菌种选择 复方参芪五味咀嚼片为中药口服固体制剂，不含生药原粉，按照2010年版《中华人民共和国药典》一部附录微生物限度检查法中的有关控制菌检查方法，应检查大肠埃希菌。

2.5.2 菌液和供试液的制备 菌液按2.3项下方法制备，菌数控制在10～100 cfu/ml。供试液按2.2项下方法制备。

2.5.3 验证方法与结果 取100 ml胆盐乳糖(BL)培养基6份，2份分别加入l0 ml供试液及1 ml 10～100 cfu大肠埃希菌悬液作为实验组，2份分别加入1ml 10～100 cfu大肠埃希菌悬液作为阳性对照组，2份分别加入稀释剂10 ml作为阴性对照组，均在35～37℃培养18～24 h。取上述各培养物0.2 ml，接种至含5 ml MUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366 nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照，依据《中华人民共和国药典》2010年版一部附录微生物限度检查方法进行判定，结果见表3。

表3 控制菌检查法验证结果

结果显示，控制菌检查阳性菌生长良好，阴性对照无菌生长。

2.5.4 样品控制菌检查 取3批样品1∶10的供试液各10 ml，分别接种至胆盐乳糖培养基100 ml中;另取大肠埃希菌的10～100 cfu/ml菌悬液1 ml、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml分别接种至同样培养基中作为阳性对照和阴性对照。按“2.5.3”项下方法操作，结果见表4。

表4 样品控制菌检查结果

结果表明，3批样品按验证方法检查，阳性对照检出大肠埃希菌，样品均未检出大肠埃希菌，阴性对照未见菌生长，结果符合规定。

3 讨论

3.1 方法验证 复方参芪五味咀嚼片采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证时，5种试验菌回收率均大于70%，表明本品对细菌、霉菌和酵母菌无抑制作用，可用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌计数检查。

3.2 菌液制备 细菌、霉菌和酵母菌计数中菌液的制备尤为重要。菌液含菌数过多或过少，在回收率测定时误差都会增大。因此需要通过反复多次试验，摸索出接种环刮取菌苔的量及稀释菌液的经验方法，在菌液制备好时，同时进行活菌计数和供试品的方法验证，才能将菌数控制在50～100 cfu/ml之间，而且在进行3次独立平行试验时，3次试验的菌原液浓度应尽量一致，除黑曲霉孢子悬液外其他试验菌菌悬液最好现用现配，这样才能保证验证结果准确可靠。

［1］中国药典.2010 年版.一部［S］.2010:附录 XIII C:79 ～88.

［2］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:351～368.