荷叶化学成分的HPLC-TOF/MS分析

周永刚，刘 畅，毛 飞，李 祥(.解放军第8医院药剂科，江苏 南京 000;.安捷伦公司，上海 0000;.北京儿童医院药剂科，北京 00056;.解放军680部队，北京 0007)

荷叶属于睡莲科植物莲的干燥叶，分布于我国大部分地区，主产于湖南、湖北、浙江、江苏等地［1］。荷叶味苦性平，归肝、脾、胃经，具有清热解暑、升发清阳、凉血止血等功效，主治暑热烦渴、暑湿泄泻、脾虚泄泻、血热吐衄、便血崩漏［2～5］。研究表明，荷叶中的生物碱和黄酮类化合物还具有降血脂、抑制胆固醇、抗有丝分裂、抑菌和止痉挛、抗氧化等活性［6～12］。目前国内外学者采用传统的植物化学的方法，对荷叶中生物碱、黄酮和挥发油进行了分离提取［13，14］，显然，这些传统方法难以系统地体现中药中多类成分的复杂性。为了能够对荷叶的药效基础作更好的阐述，本研究采用HPLC-TOF/MS技术对荷叶中多成分进行了鉴别，该法操作简便、可靠，对阐明荷叶药效物质基础和质量控制具有一定的参考价值。

1 仪器和试药

安捷伦1200型液相色谱仪，包括在线脱气机，二元泵，高性能自动进样器;安捷伦G6210A飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源(ESI)，MassHunter色谱工作站和Qualitative Analysis质谱分析软件。

荷叶购于上海雷允上大药房，荷叶碱标准品购自中国生物制品检定所，乙腈为色谱纯(Fisher，USA)，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 供试品溶液制备 用粉碎机将药材荷叶均匀粉碎，取细粉约2 g(过40目筛)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 ml，密塞，称定重量，超声提取30 min，放置冷却，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 液相色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SBAq C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈和1.0%醋酸(用氨水调 pH 至6.2±0.1);A 相为乙腈，B相为1%醋酸，梯度洗脱;梯度洗脱程序如下:0～50 min，0～30%A;50～90 min，30% ～75%A;进样量10 μl;流速:1.0 ml/min，柱温:25 ℃。

2.2.2 TOF/MS质谱条件 采用ESI离子源，正离子模式下(ESI+)，柱后分流比为3∶1，具体参数如下:毛细管电压4 000 V，雾化气压力40 psig，干燥气流速10 ml/min，干燥气温度350℃，碎片电压选择120 V和200 V;参比离子m/z 121.050 8和922.009 7;质量数扫描范围m/z 100～1 000。

2.3 荷叶中化学成分数据库的建立 根据有关荷叶药材化学成分研究的报道，收集了生物碱类、黄酮类等化学成分共38个，并通过安捷伦“Formula-Database-Generator”软件建立荷叶药材中已知化学成分的数据库。

3 结果和讨论

3.1 实验条件优化 首先考察了甲醇-水和乙腈-水两种体系，结果显示乙腈的洗脱效果要优于甲醇，故选择乙腈作为有机相。由于荷叶中主要含有黄酮类成分和生物碱类成分，为保证生物碱类成分具有较好的峰形，所以在流动相中加入少量氨水。一般调pH值常用的试剂为三乙胺和氨水，但三乙胺在质谱中有较大的残留，多次进样后会对定性鉴别产生较大的干扰，所以，选择在流动相中添加氨水，避免残留离子的干扰。同时，为了保证总离子流图有较好的重现性，在每次配制流动相的时候控制水相的pH值为6.2±0.1。质谱检测分别比较了正、负离子两种扫描模式，结果发现正模式下峰容量更大、质谱响应更强，故实验最终选择在正模式下进行。

3.2 荷叶中化学成分的鉴别 在优化的色谱质谱条件下，荷叶提取液的HPLC-TOF/MS典型总离子流图见图1。从图中看到有超过25个峰被检测到，我们对其中的14个峰进行了详细的鉴别。通过对比标准物质的保留时间和质谱图，可以判定峰13为荷叶碱。其它化合物由于没有标准品进行比对，按照以下方法鉴别:首先，我们根据TOF/MS上所得到的精确化合物分子量信息，通过MassHunter软件在3 ppm的质量偏差范围内计算其可能的元素组成，并将其与所建的数据库相匹配，对荷叶化学成分的初步鉴别。然后，调节碎片电压至200 V，获得化合物结构相关的碎片离子，根据离子的裂解情况，结合数据库中各化合物的化学结构，对荷叶化学成分进行进一步的鉴别，结果见表1。

图1 荷叶提取物TOF/MS总离子流图

表1 荷叶化学成分鉴别结果

以峰1为例，来说明鉴别过程。在碎片电压在120 V的条件下，得到其质谱图(图2(a))，测得其分子离子峰为272.128 1，元素组成为C16H17NO3，根据数据库匹配我们初步鉴定该化合物为去甲基乌药碱。调节碎片电压至200 V，得到此电压条件下的质谱图(图2(b))，发现有很强的脱NH3(17 Da)的碎片离子，推测该碎片离子为其B环的Retro Diels-Alder(RDA)裂解碎片，这说明该结构中的N上没有甲基取代，然后根据质谱图上明显的255.088 0［M-NH2］+、237.077 6［M-NH2-CO］+、209.085 7［M-NH2-CO-CO］+、164.058 1［MC7H8O］+、163.046 7［M-NH2-C6H6O］+和143.036 6［M-NH2-C6H8O2］+等碎片离子的信息，推断出裂解途径见图3所示。结合以上信息，我们能够鉴定峰1为去甲基乌药碱。

图2 120 V(A)与200 V去甲基乌药碱(B)碎片离子质谱图

去甲基乌药碱ESI-MS裂解途径如下:

采用类似的方法，能够对峰2～14也进行相应的鉴别。峰2显示的分子离子峰为286.143 3，分子式为 C17H19NO3，产生碎片离子 269.103 6［MNH2］+、237.077 1［M-NH2-CH3OH］+、209.081 1［M-NH2-CH3OH-CO］+、178.071 7［M-C7H8O］+和 175.061 0［M-NH2-C6H6O］+，故判断其为乌药碱;峰 3、4、6的分子离子峰分别为 300.160 3、300.159 4和300.159 5，三者具有相同的分子式C18H21NO3，其中峰3在200 V电压下能够产生碎片离子 269.104 4［M-NH2CH3］+、237.078 3［MNH2CH3-CH3OH］+、209.084 1［M-NH2CH3-CH3OH-CO］+和 192.088 8［M-C7H7O］+，峰 4 则另有特征性的碎片离子175.060 3［M-NH2CH3-C6H6O］+和 143.036 6［M-NH2CH3-C7H10O2］+，峰6所产生的碎片离子为 283.117 4［M-NH2］+、252.098 6［M-NH2-CH3OH］+、237.076 4［M-NH2-CH3OH-CH3］+、209.078 9［M-NH2-CH3OH-CH3-CO］+、192.086 4［M-C7H8O］+、189.075 6［MNH2-C6H6O］+，根据三者所具有的碎片离子的不同，判断峰3为N-甲基异乌药碱，峰4为N-甲基乌药碱，峰6为N-去甲亚美罂粟碱;峰5的分子离子峰为465.103 6，化学式为 C21H20O12，产生的碎片离子为 377.120 8［M-C5H10O］+、303.052 4［MC6H10O5］+，根据裂解规律判断为异槲皮苷;峰7的分子离子峰为286.143 2，化学式为C17H19NO3，产生碎片离子 269.103 6［M-NH2］+、254.079 3［M-NH2CH3］+、237.076 3［M-NH2-CH3OH］+和209.081 4［M-NH2-CH3OH-CO］+，判断为 N-去甲甲基乌药碱;峰8的分子离子峰为314.176 4，化学式为 C19H23NO3，产生的碎片离子为283.117 6［M-NH2CH3］+，、252.098 2［M-NH2CH3-CH3OH］+和206.111 3［M-C7H8O］+，判断峰 8 为亚美罂粟碱;峰9和峰10的分子离子峰为 282.150 7和282.148 9，共同的元素组成C18H19NO2，峰9有很强的-31 的251.106 9［M-NH2CH3］+碎片离子，推测此结构的氮原子上有甲基取代，峰10则有很强的-17的265.122 2［M-H2NH］+碎片离子，推测该碎片离子为其B环的RDA裂解碎片，而该结构中N上没有甲基取代，根据分析和数据库匹配，判断峰9为O-去甲基荷叶碱，峰10为 N-去甲基荷叶碱;峰11的分子离子峰为266.227 6，化学式为C17H15NO2，产生碎片离子 249.091 0［M-H2NH］+、219.080 4［MH2NH-CH2O］+、191.085 3［M-H2NH-CH2O-CO］+，判断为番荔枝碱;峰12的分子离子峰为312.150 9，化学式为 C19H21NO3，其碎片离子为 283.125 3［MCO］+、269.108 8［M-CH2CH2NH］+、251.098 0［MCO-CH3NH2］+、254.087 1［M-CH2CH2NH-CH3］+、225.185 5［M-CH2CH2NH-CH3-CO］+，判断其原荷叶碱;峰14的分子离子峰为280.133 8，化学式为C18H17NO2，产生碎片离子249.083 1［MNH2CH3］+、219.072 2［M-NH2CH3-CH2O］+和191.077 2［M-NH2CH3-CH2O-CO］+，根据裂解情况推断其为斑点亚洲罂粟碱。

4 结论

本实验采用HPLC－TOF/MS技术，结合数据库匹配技术和碎片离子分析，对荷叶中的主要化学成分进行了鉴别，共确定了14个荷叶中的主要生物碱类和黄酮类成分。利用TOF/MS在高碎片电压下产生的丰富的碎片离子信息，进一步明确鉴别了一系列非靶标成分，并总结了荷叶中化学成分的一般裂解规律。该方法快速，灵敏，准确度高，可作为荷叶质量控制的方法之一，同时为荷叶的药理学和临床药效学研究提供了化学物质基础信息。

［1］钟先锋，黄桂东.荷叶成分及功能的研究进展［J］.食品与机械，2006，22(4):138.

［2］王玲玲，刘 斌，石任兵.荷叶的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2009，21:416.

［3］刘树兴，赵 芳.荷叶功能成分研究进展［J］.食品工业科技，2008，04:321.

［4］张国庆，冯习坤，曾为驰，等.荷叶的化学和药理研究进展［J］.药学实践杂志，2010，28(5):328.

［5］王福刚，曹 娟，刘 斌，等.荷叶的化学成分及其药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21(9):2339.

［6］杨冀艳，胡 磊，许 杨.荷叶黄酮类化合物的研究进展［J］.食品科学，2007，08:554.

［7］王玲玲，刘 斌，石任兵.荷叶黄酮类化学成分研究［J］.北京中医药大学学报，2008，02(31):116.

［8］雷红松，肖文军，魏 勇.荷叶生物碱的研究进展［J］.2007，05(28):92.

［9］单 斌，邓泽元，熊冬梅.荷叶中生物碱的提取及组成成分分析［J］.食品科技，2008，10:163.

［10］肖桂青，卢向阳，田 云.荷叶中生物碱类成分的研究进展［J］.化学与生物工程，2006，05(23):1.

［11］罗金波，肖文军，刘仲华.荷叶生物碱类成分的研究进展［J］.药学进展，2008，18(3):9.

［12］孔文琦，李严巍，荷叶活性化学成分及药理研究进展［J］.中药研究与信息，2005，7(6):22.

［13］聂 波，佟丽华，于 敏.荷叶化学成分的分离分析［J］.黑龙江医药科学，2003，26(4):54.

［14］曾虹燕，苏杰龙，方 芳，等.不同方法提取的荷叶挥发油化学成分分析［J］.西北植物学报，2005，25(3):578.