西替伪麻缓释片中盐酸伪麻黄碱的人体药动学研究

金晓玲，高守红，邬 蓉(第二军医大学长征医院药学部，上海 200003)

西替伪麻缓释片为盐酸西替利嗪和盐酸伪麻黄碱组成的复方制剂。盐酸伪麻黄碱是麻黄碱的差向异构体，临床所用的为右旋伪麻黄碱(PSE)，可选择性收缩呼吸道血管，消除鼻黏膜水肿，在许多抗感冒药中常常含有该成分［1，2］。本研究是以缓释成分盐酸伪麻黄碱为指标观察人单剂量口服西替伪麻缓释片后血药浓度经时过程，估算相应的药代动力学参数。由于伪麻黄碱血药浓度低，需要高灵敏方法进行测定，而 HPLC 法［3～5］检测灵敏度低，采用 GC-MS法［6］测定时需要对样品进行衍生化处理，操作烦琐。采用 LC-MS 法［7，8］测定血浆中伪麻黄碱的浓度，虽然方法灵敏度有所提高，但重现性不好，测定时间较长。考虑到临床生物样本量大、稳定性差、浓度低、专属性要求高等特点，笔者建立了快速测定人血浆中伪麻黄碱的LC-MS/MS方法，1个样品的测定时间仅需2.5 min，1 d能测定500多个样品，快速而简便地分析大量的血浆样品，为临床试验提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和药品 Agilent 1200液相色谱-Agilent 6410型三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司);Agilent 6410 B.01.03 定量处理软件;飞鸽牌TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂);旋涡振荡混和器 WL-901 Vortex(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。伪麻黄碱对照品(含量99.3%，中国药品生物制品检定所)。西替伪麻缓释片(上海信谊药业有限公司，批号090320);盐酸金刚烷胺(内标，中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯试剂(德国Merck公司);水为纯净水。

1.2 色谱分离条件 色谱柱为Agilent Zorbax SBC18(150 mm × 2.1 mm，3.5 μm)，流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)，流速为0.3 ml/min，柱温为30℃。

1.3 质谱分离条件 采用ESI离子源，正离子检测，选择MRM工作方式进行一/二级质谱分析。用于定量分析的检测离子为:伪麻黄碱［M+H］+m/z 148.1→m/z 132.1，内标盐酸金刚烷胺［M+H］+m/z152.0→m/z135.1，见图1。干燥气流速为 10 L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40 psi，毛细管电压为4 000 V。

图1 伪麻黄碱和内标的ESI-MS质谱图

1.4 受试者与试验设计 本临床试验方案经长征医院伦理委员会审核批准，在试验过程中受伦理委员会指导，试验过程中无不良反应发生。10名男性健康志愿者，年龄(21.8±1.22)岁，体重(66.8±3.9)kg，肝肾功能及心电图正常，试验前1周及试验期间禁用其他药物，试验期间禁烟、酒、茶并签署知情同意书。在禁食12 h后，于次日晨空腹口服西替伪麻缓释片2片(含盐酸西替利嗪10 mg，盐酸伪麻黄碱240 mg)，用200 ml温开水送服。服药后4 h方可统一进食标准餐。于给药前及给药后 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 和36.0 h 于静脉取血3 ml，3 500 r/min 离心10 min，分离血浆后置 －20 ℃冰箱保存。

1.5 血浆样品预处理 取血浆200 μl置于 －1.5 ml塑料离心管中，加入400 μl乙腈(含内标盐酸金刚烷胺5 ng/ml)，涡旋振荡1min，于12 000 r/min高速离心 10 min，取上清液 200 μl加入 200 μl 0.1%甲酸溶液，涡旋混匀后取10 μl进样，峰面积内标法定量分析。

1.6 含量测定的方法学考察 用健康空白血浆精密配制成 2.5、5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1 000.0 ng/ml浓度的伪麻黄碱标准血浆样品，按1.5项下方法操作，制备血浆标准曲线。配制5.0、50.0和500.0 ng/ml 3种不同浓度的伪麻黄碱血浆质控样品，按1.5项下方法操作，进行回收率、基质效应及日内、日间精密度考察。还考察了伪麻黄碱血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性、血浆样品经样品处理后室温放置24 h的稳定性以及血浆样品在－20℃保存60 d的稳定性。

1.7 药动学参数计算 采用统计矩法计算药代动力学参数，Cmax、tmax采用实测值，AUC采用梯形面积法计算，λz为末端相消除速率常数，用末端相浓度对数与时间回归直线求得:t1/2=0.693/λz。

2 结果

2.1 方法专属性 在上述色谱条件下，伪麻黄碱和内标峰形良好，伪麻黄碱和内标的保留时间分别为1.59 min和1.82 min(图2)。血浆中内源性杂质均不干扰药物的测定。

2.2 方法学考察 结果表明伪麻黄碱在2.5～1 000.0 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为A=0.002 3C+0.003 4(r=0.995 2)。伪麻黄碱在血浆中最低定量检测限为2.5 ng/ml，RSD为8.46%。低、中、高3种浓度的日内及日间精密度分别＜5.7%和＜11.6%，萃取回收率 ＞78%，基质效应在103.0% ～107.7%之间。伪麻黄碱血浆样品经历3次冷冻-解冻循环后稳定，RSD为9.54%;血浆样品经样品处理后室温放置24 h稳定，RSD为8.91%。血浆样品在－20℃保存60 d其浓度无明显变化，说明其在－20℃条件下，药物在血浆中可稳定存在。

2.3 药动学结果 10名健康志愿者单剂量口服西替伪麻缓释片二片(含盐酸西替利嗪10 mg，盐酸伪麻黄碱240 mg)，用LC-MS/MS测定其血药浓度，按“1.7”项方法计算，体内盐酸伪麻黄碱药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间 (MRT)、峰浓度 (Cmax)、峰时间 (tmax)、AUC0～36、AUC0～∞分别为:(7.32 ± 0.97)h，(12.41 ± 1.46)h，(706.64 ±113.72)ng/ml，(6.8 ±1.0)h ，(9 269.72 ±1 598.13)ng·h/ml和(9 638.65 ±1 793.59)ng·h/ml。西替伪麻缓释片中盐酸伪麻黄碱的体内主要药代动力学参数与文献报道基本一致。

3 讨论

本文采用ESI正离子模式，对所测定的伪麻黄碱及其内标盐酸金刚烷胺的电离条件进行优化，［M+H］+峰容易生成有规律的碎片，便于MS/MS测定，经过优化质谱和色谱条件，最终可以满足伪麻黄碱及其内标盐酸金刚烷胺血药浓度的测定。

由于伪麻黄碱分子结构中含有碱性氮原子，所以流动相的pH值对其保留时间有一定影响。用甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)作为流动相时分离效果最好。因伪麻黄碱为弱碱性药物，通常合成盐酸盐可增加溶解度，其血样的提取一般采用乙醚、乙醚-正乙烷、甲基叔丁基醚等有机溶剂提取，但常有乳化现象产生，操作过程烦琐，耗时长，成本较高。而采用蛋白沉淀法进行血样处理，操作简单，选择沉淀剂时，曾探讨使用甲醇、乙腈等蛋白沉淀剂处理生物样品，结果使用乙腈提取回收率较高，但若用上清液直接进液质，峰形不佳且响应较低，将上清液用水、流动相、0.1%甲酸、0.3%甲酸、0.5%甲酸分别1∶1和1∶2稀释，结果发现用0.1%甲酸1∶1稀释，提取回收率最高，达78%左右。本实验所需血浆样品量少，前处理采用蛋白沉淀，操作简便，分析测定时间短，在处理大批量血浆样品时可大大减少工作量和节省时间。

伪麻黄碱在人体血浆中的浓度较低，采用HPLC-UV法测定时，有时可观察到少量杂质干扰其低浓度测定。为保证临床大量且复杂生物样本分析的专属性和准确性，本实验建立了伪麻黄碱人血浆样本LC-MS/MS分析方法，可以选择性的检测选定的离子以及该离子所产生的子离子，因而选择性很高，而对LC的分离要求不高，甚至可以不通过LC分离而直接将混合样品进入MS进行测定，故可以实现快速分离。空白血浆无杂质干扰，最低定量检测浓度可达2.5 ng/ml，完全满足临床血药浓度监测的要求。

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