吡格列酮配合生活干预对自发性高血压大鼠AT1受体及mRNA的影响

陈海燕 李 杰 孙艳伏 唐文娟 王 赞 (吉林大学第一医院干部病房，吉林 长春 130021)

原发性高血压的发展与胰岛素抵抗(IR)密切相关，纠正IR可以达到良好的降压作用和心血管保护作用〔1，2〕。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)功能亢进，特别是血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)功能亢进与高血压的发生发展以及靶器官损害关系非常密切。本研究对自发性高血压大鼠(SHR)应用吡格列酮(PIO)配合生活方式干预，检测定心肌及主动脉组织AT1R和mRNA表达水平，探讨PIO配合生活方式干预的降压作用和心血管保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SHR大鼠33只，雄性，购自北京维通利华公司，鼠龄6～7 w，体重120～160 g，分为4～6只/笼饲养，室温20℃ ～24℃，控制昼夜光照，避免过多噪声及其他干扰。观察期为1 w，实验期为12 w。

1.2 分组及给药方法 全部大鼠随机分为三组，每组11只，观察饲养1 w使大鼠适应环境。①SHR空白组(SHR)，给予鼠粮及清水。②硝苯地平(N)组，硝苯地平加入饮水中，浓度140 mg/L。③PIO配合生活干预组(P)，盐酸吡格列酮(批号:H20050200，厂家:日本武田药品工业株式会社)45 mg/L，加入饮水中，同时给予生活方式干预。

1.3 生活干预方法 ①饮食控制方法:实验开始后，SHR组及N组大鼠不限制鼠粮及饮水，每周测量1次SHR组大鼠24 h进食量;计算平均进食量，P组每日清晨给予SHR组前一周每日平均进食量的90%;②游泳方法及条件:P组大鼠第1周游泳时间为6～8 min，第12周时可坚持到15 min，呈逐渐延长趋势，同一时间在安静条件下进行，以大鼠漂浮水面不动并出现头部下沉为停止信号，水温28℃ ～30℃，水深50 cm，保证大鼠不能触及底部及侧壁逃避运动。实验期间大鼠无意外死亡。

1.4 原位杂交和免疫组化

1.4.1 标本采集及保存 乙醚麻醉后，沿正中线剪开大鼠胸腔，摘取心脏及主动脉组织，将其切成3 mm×3 mm标本。用10%中性缓冲甲醛固定24 h后酒精逐级脱水，浸蜡块后作5 μm连续切片，备免疫组化和原位杂交之用。

1.4.2 原位杂交探针的制备 原位杂交探针购于武汉博士德生物工程有限公司。AT1R多相寡核苷酸探针的碱基序列为:①5'-CGAGC TCCCT CTGAG TCAGG AAACA TTTTC-3';②5'-CTGGC CCCTG TCATC TTCTG TCCCT TCCCA-3';③5'-TGAGC GCTTC GAGAT GTTCC GAGAG CTGAA-3'。

1.4.3 原位杂交 采用标记探针技术，按说明书操作(试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色。

1.4.4 免疫组化 采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC)，按说明书操作(试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色。

1.4.5 结果判定 在心肌细胞、血管壁细胞膜和胞质内出现棕褐色颗粒，且着色强度高于背景的特殊染色者判为阳性。应用LX70 Olympus显微镜 CooledCCD采集视野图片，用计量分析系统(Image-Pro pius Analysis software)进行分析。

2 结果

2.1 大鼠心肌及主动脉AT1R免疫组化结果 各组大鼠心肌细胞质及主动脉内皮细胞中均可见AT1R阳性信号表达，以SHR组着色强度最深，呈棕黄色。通过染色密度扫描计算，N组着色强度略低于SHR组，差异没有统计学意义(P＞0.05);P组大鼠心肌及主动脉组织AT1R表达均明显低于SHR组及N组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表1，图1。

2.2 大鼠心肌及主动脉AT1原位杂交结果 大鼠心肌细胞质及主动脉内皮细胞均可见不同程度的AT1mRNA表达。通过染色密度扫描计算，P组大鼠心肌及主动脉组织AT1mRNA表达均明显低于SHR组及N组，且差异具有统计学意义(P＜0.01)，N组大鼠心肌及主动脉组织AT1mRNA表达均略低于SHR组，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2，图2。

表1 大鼠心肌和主动脉AT1R免疫组化灰度测定值(±s，n=11，%)

表1 大鼠心肌和主动脉AT1R免疫组化灰度测定值(±s，n=11，%)

与SHR组比较:1)P＜0.01;与N组比较:2)P＜0.01，下表同

组别 心肌 主动脉SHR组27.3±2.9 14.2±1.9 N组 25.6±2.7 13.9±1.8 P组 16.8±1.21)2) 6.5±0.71)2)

表2 大鼠心肌及主动脉AT1原位杂交灰度测定值(±s，n=11，%)

表2 大鼠心肌及主动脉AT1原位杂交灰度测定值(±s，n=11，%)

组别 心肌 主动脉SHR组24.3±2.4 12.3±1.5 N组 20.6±2.1 11.1±1.3 P组 10.4±1.21)2) 5.2±0.71)2)

图1 各组大鼠心肌和主动脉AT1R免疫组化结果(DAB，×200)

图2 各组大鼠心肌及主动脉AT1原位杂交检测结果(DAB，×200)

3 讨论

高血压的发生、发展与IR关系密切，研究表明高血压人群约60%伴有 IR〔3，4〕。本课题组曾用 PIO配合生活干预治疗SHR，发现其有很好地降低SHR血压、血脂作用，同时可以纠正或减低SHR心肌及主动脉内皮、内膜外脂质和血管平滑肌一些超微结构方面的改变，对高血压所致靶器官损伤具有预防和缓解作用〔2，5，6〕。

高血压所致各种靶器官损害均与组织重构、特别是血管重构关系密切，如果能够逆转或阻止血管重构即可以达到降低血压和保护靶器官的作用。RAAS与高血压的发生发展和血管重构、靶器官损伤关系密不可分，血管紧张素Ⅱ灌注的大鼠血压明显增高，并呈现血管重构方面的形态学改变和IR，经应用噻唑烷二酮类药物IR得到纠正，伴有血压降低和血管重构形态方面的改善，而噻唑烷二酮类药物是通过AT1、PI-3K、TNF-α等途径发挥降压和防止血管重构的作用，并认为其对AT1R的作用至关重要〔7，8〕。

本研究发现SHR心肌间血管内皮细胞着色明显，出现黄褐色颗粒，并有部分心肌细胞内出现黄褐色颗粒。说明AT1R含量较高，其原因可能是调控AT1R的基因转录活跃，致使mRNA表达相应增加，使AT1R表达量提高。另一种可能的解释就是mRNA降解缓慢，作用时间延长，使AT1R表达量提高。AT1R和mRNA在心肌间血管内皮细胞和部分心肌细胞内的表达提示两方面的作用:(1)RAAS系统通过AT1R在SHR血管壁细胞的表达，参与和启动血管内皮功能损伤、内膜下脂质沉积和纤维组织增生、平滑肌细胞迁移和增殖等一系列病理改变。成为高血压导致血管重构、靶器官损伤至关重要的途径，并可能促成和启动动脉壁粥样硬化病变的发生和发展。(2)左心室肥厚是高血压心脏受损导致心功能不全和一些心律失常的重要原因，严重者可以在临床导致心源性猝死。本研究结果显示AT1R在部分心肌细胞和心肌间质细胞中表达，说明高血压病在左室肥厚的形成和发展过程中RAAS参与其中。RAAS通过AT1R的作用诱发各种类型细胞(包括心肌细胞和心肌间质细胞、成纤维细胞等)肥大和增生，构成高血压左室肥厚的组织学基础。

经PIO配合生活干预治疗后AT1R和mRNA在大鼠心肌及主动脉的表达呈现出相同的变化规律。黄褐色颗粒在心肌间血管内皮细胞和部分心肌细胞中出现的比例和灰度均明显降低。说明经PIO配合生活干预治疗SHR心肌AT1mRNA和受体表达受到抑制。提示这种组合治疗可能对SHR血管和心脏重构具有减缓或阻止作用。

总之，本研究结果显示PIO配合生活方式干预可以明显降低SHR的血压，并对SHR AT1mRNA和受体的表达产生抑制作用，发挥降压和心血管保护作用。

1 Reaven GM.Insulin resistance hyperinsulinemia and hypertriglyceridemia in etiology and clinical course of hypertension〔J〕.Am J Med，1991;90:7s-12s.

2 陈海燕，李 杰，王 威.吡格列酮配合生活方式干预对SHR大鼠降压及主动脉壁保护作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(13):1854-6.

3 Zemel MB.Insulin resistance vs.hyperinsulinemia in hypertension:insulin regulation of Ca2+transport and Ca2+regulation of insulin sensitivity〔J〕.J Nutr，2005;125(6 Suppl):1738S-1743S.

4 Guo X，Cheng S，Taylor KD，et al.Hypertension genes are genetic markers for insulin sensitivity and resistance〔J〕.Hypertension，2005;45:799-803.

5 王 威，孔 俭，李 杰，等.吡格列酮配合生活方式干预对SHR大鼠降压作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(14):1988-90.

6 王 威，孔 俭，陈海燕，等.吡格列酮配合生活方式干预对SHR大鼠血压及糖脂代谢的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(18):2629-30.

7 Schiffrin EL，Amiri F，Benkirane K，et al.Peroxisome proleferator-activated receptor vascular and cardiac effects in hypertension〔J〕.Hpertension，2003;42(9):1295-314.

8 陈海燕，李 杰，梁虹霞.罗格列酮对SHR大鼠降压作用和靶器官保护机制研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(20):1970-3.