尿毒清颗粒对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中氧化应激变化的影响

胡志娟 郭 岚 史亚男 董春霞 贾晓梅 刘 冰 牛 凯

(河北省人民医院肾内科，河北 石家庄 050051)

肾间质纤维化(RIF)是导致各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路。大量的研究均证实肾小管-间质的损害程度与慢性肾脏疾病(CKD)患者的肾功能损害程度呈正相关〔1〕。在各种病因导致的肾脏损伤过程中，氧化应激起到重要的作用〔2～4〕。转化生长因子β1(TGF-β1)是公认的致纤维化因子。本研究采用大鼠单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾间质纤维化模型，观察UUO模型氧化应激指标及TGF-β1的变化，探讨氧化应激在肾间质纤维化形成过程的作用，以及药物对肾间质纤维化大鼠肾功能的影响和作用机制，为肾间质纤维化的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 健康雄性SD大鼠24只(由河北医科大学动物室提供)，体重150～180 g，随机分成4组:(1)正常对照组(n=6);(2)假手术组(n=6);(3)手术组(UUO组，n=6);(4)尿毒清组(n=6)。大鼠用硫喷妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，大鼠腹部正中偏左纵切口2 cm打开腹腔，暴露左肾，钝性分离左输尿管，于靠近肾盂段处行左输尿管结扎后缝合腹腔;假手术组打开大鼠腹腔后仅分离左输尿管，不结扎。模型建立后第二天起，每日早上8:00予用药组尿毒清颗粒(广州康臣生产)50 mg/kg灌胃(溶于注射用水);其余组予等量注射用水灌胃。术后14 d处死大鼠，观察结果。

1.2 生化测定 大鼠处死时以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏取血标本约3 ml。血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的测定在Beckman全自动生化分析仪上完成。

1.3 总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量测定

黄嘌呤氧化酶法测定左肾组织T-SOD活力、硫代巴比妥酸(TBA)法测定左肾组织MDA含量。试剂盒为上海朗顿产品。

1.4 TGF-β1的 RT-PCR分析 均采用 TRIzol(Invitrogen公司)试剂一步抽提总RNA，再逆转录成cDNA(逆转录酶AMVRT购自美国Promega公司)。以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶(Promega公司)催化下行PCR，引物由上海生物工程公司合成。actin:正链5'-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3'，负链5'-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3';扩增条件为95℃5 min，然后95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s(35 个循环)，72℃延伸5 min;扩增目的片段长度为375 bp。TGF-β1:正链5'-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C-3'，负链5'-CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C-3';扩增条件为 94℃2 min，然后 94℃30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s(27 个循环)，72℃延伸 5 min;扩增目的片段长度为298 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml溴乙啶)，再用UVP凝胶图像成像系统进行分析，以待检测指标与actin吸光度比值来表示其相对含量(目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度/actin基因条带吸光度)。

1.5 肾组织病理 经4%多聚甲醛固定肾组织石蜡包埋，制成4 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化行HE染色。

2 结果

2.1 一般情况 肉眼观察，假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红;UUO组梗阻侧肾脏肿大，颜色变浅，有囊性感，内含褐色混浊尿液，肾实质变薄，尿毒清组介于二者之间。

图1 TGF-β1 mRNA在四组大鼠肾组织的表达

2.2 各组BUN、Scr、T-SOD活力及MDA含量 与假手术组比较，UUO组BUN、Scr升高(P＜0.05)，肾组织匀浆中MDA含量增加(P＜0.05)、T-SOD活性降低(P＜0.05)，尿毒清治疗后以上指标明显好转(P＜0.05)。见表1。

2.3 各组TGF-β1 mRNA的表达 与假手术组比较，UUO组TGF-β1 mRNA的表达明显增加(P＜0.01)，尿毒清治疗后TGF-β1mRNA的表达下调(P＜0.01)。见表1，图1。

2.4 肾脏病理改变 光镜下可见(HE染色)UUO组大鼠肾间质炎细胞弥漫性浸润，局灶性加重，肾小管明显扩张，小管内见大量细胞管型，肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，肾小球、小血管未见明显病变;尿毒清组肾间质炎细胞多灶性浸润，部分小管扩张、上皮细胞肿胀，空泡变性。见图2。

表1 各组大鼠肾功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表达比较(± s，n=6)

表1 各组大鼠肾功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表达比较(± s，n=6)

与假手术组比:1)P＜0.05;与手术组比:2)P＜0.05

组别 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) T-SOD(U/mg) MDA(nmol/mg) TGF-β1 mRNA正常对照组 3.88±1.59 52.10±10.52 260.62±50.89 1.82±0.41 0.198±0.035假手术组 3.92±1.61 54.25±11.21 255.48±54.17 1.85±0.32 0.201±0.004 UUO组 10.90±1.721) 88.54±12.7481) 125.04±40.791) 3.98±0.791) 0.775±0.0141)尿毒清组 6.50±1.581)2) 72.10±14.661)2) 187.27±40.791)2) 2.75±0.651)2) 0.519±0.0291)2)F值 24.76 11.40 11.70 18.13 818.36 P值0.000 0 0.000 1 0.000 1 0.000 0 0.000 0

图2 各组大鼠肾组织HE染色结果(×100)

3 讨论

目前认为，肾间质纤维化是各种炎症和非炎症性肾脏疾病进展的最终结局，是所有慢性进行性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同形态学特点〔5，6〕。UUO是目前常用的肾小管间质损伤模型之一，是主要累及肾小管间质的非免疫源性进行性肾损害的实验动物模型。持续输尿管梗阻导致肾小管扩张和肾间质缺血，引起肾小管上皮细胞及血管内皮细胞损伤，继而出现以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞数量减少和间质纤维组织增生，进而发展为小管萎缩和间质纤维化〔7〕。

目前研究认为，TGF-β1在肾间质纤维化发生发展的多个环节中起重要作用，是主要的致纤维化因子之一。主要表现在:①促进细胞外基质合成，可促进多种ECM成分如Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原和多种蛋白多糖的生成，抑制降解ECM成分的酶的合成，同时促进整合素表达而增强细胞外基质相互作用。②TGF-β1通过自分泌和旁分泌方式作用于成纤维细胞和单核细胞，促进细胞外基质及细胞因子的表达分泌，从而促进纤维化进程〔8，9〕。本实验显示梗阻肾间质TGF-β1的表达明显增多，表明TGF-β1的高水平表达加速间质纤维化的进程。

氧化应激是导致细胞损伤、衰老和死亡的主要原因之一，在心血管疾病、肝肺纤维化、神经退行性疾病和癫痫等重要疾病中也扮演着重要角色。肾组织需要较高的氧耗来完成水和电解质的主动转运和重吸收，所以肾小管易受到氧化损伤。研究表明肾脏缺血再灌注损伤和顺铂细胞毒均可引起肾间质内氧化应激得增加〔10〕。目前认为，UUO模型肾脏病理损伤与肾缺血、低氧、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、转化生长因子 β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)产物诱发的损伤有关。脂质过氧化是指在自由基的攻击下不饱和脂肪酸发生过氧化反应，从而生成一系列活性氧的复杂过程。脂质过氧化使膜完整性破坏，引发细胞周围炎症;MDA是在氧自由基作用下发生脂质过氧化反应的一种产物，其本身也能破坏细胞膜的结构与功能，对细胞具有毒性，并能刺激间质细胞胶原基因表达，MDA量的变化提示体内脂质过氧化，间接反映细胞损伤的程度。SOD能清除超氧化物阴离子，可拮抗脂质过氧化，其活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。

尿毒清颗粒由大黄、黄芪、甘草、茯苓、川芎、丹参、白术、制何首乌、姜半夏等组成，具有扶正益气、祛浊解毒、化瘀生新作用。尿毒清颗粒作为中药复方制剂，具有多因素、多靶点、综合表现药效的特点。主要成分大黄具有抑制细胞因子、生长因子生成，抑制肾小球系膜细胞增生及成纤维细胞的增殖作用。

本试验结果表明在UUO模型肾小管间质病变中氧化应激增加，尿毒清治疗后氧化应激指标下调，肾间质纤维化减轻。氧化应激反应产物的增加可能在UUO模型肾小管间质病变中有重要的作用。因此，在慢性肾衰竭的预防与治疗中，抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基等方法可作为抗肾间质纤维化有效的措施。

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