巴戟天对D-半乳糖致衰老大鼠心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达的影响

张丽娜 张天良 金国琴 (上海中医药大学生化教研室，上海 20203)

组织多普勒心脏超声检查表明老年人心肌收缩和舒张功能均有不同程度的降低〔1〕。衰老最有代表性的是自由基学说，认为衰老机体自由基含量增多〔2〕。而自由基对蛋白质的影响是衰老的关键因素。肌球蛋白和肌动蛋白是重要的骨架蛋白，在心肌肌肉舒缩中有重要作用。人体从发育至衰老死亡，中医认为是肾气盛衰的过程，肾为先天之本。本研究选择补肾益气中药——巴戟天作用衰老大鼠心肌细胞模型，研究其对衰老心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达是否具有改善作用;检测衰老心肌细胞模型中的肌球蛋白和肌动蛋白的表达变化，探讨衰老心肌收缩功能衰退的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 24 h内的SD新生大鼠，雌雄不拘。由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂 胰蛋白酶(Amresco)，Ⅰ型胶原酶(Invitrogen)，Ⅱ型胶原酶(Invitrogen)，DMEM-F12(Gibco)，胎牛血清(FBA，Gibco)，5-溴脱氧尿嘧啶(Sigma)，二甲基亚砜(DMSO，ICN)，噻唑蓝(MTT，Sigma)，β-半乳糖苷酶活性测定试剂盒(Cell Signaling)，Ttizol(Invitrogen)，PCR 反转录试剂盒、dNTP、Taq聚合酶(Fermentas)，小鼠抗兔α-actin单克隆抗体(Santa cruz)。

1.1.3 主要实验设备 灭菌锅(造鑫企业有限公司)，超净工作台(造鑫公司)，恒温CO2培养箱(Heraeus)，冷冻离心机(Eppendorf)，恒温震荡水浴箱(上海精宏设备公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，PCR扩增仪(Bio-Rad)，酶联免疫检测仪(Bio-TEC)，凝胶扫描及分析系统(上海复日科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞的原代培养及纯化方法〔3，4〕出生24 h以内的SD大鼠数只，乙醇消毒后处死，手术剪取心，置生理盐水中。用小弯镊取心尖部，至D-hanks液中，清洗，剪碎。加入胰酶混合液5 ml(0.125%胰酶+0.03%胶原酶Ⅱ+0.1%胶原酶I)，80 r/min 37℃震荡水浴箱7 min，弃上清。重复该步骤。向沉淀中加入胰酶混合液5 ml，吹打数次，消化10 min(80 r/min 37℃震荡水浴箱10 min)，取出后反复轻柔吹打1 min，自然沉淀得到上清与沉淀。上清经200目筛网过滤至一置于冰上的内放20 ml含10%FBA的DF12小烧杯中，以终止消化。沉淀加入胰酶混合液，同上消化5 min，反复吹打1 min，将上清移入前烧杯中。重复该步骤，直到沉淀消失为止。总消化时间控制在0.5 h以内。由以上步骤得到的上清总量均分为两管，4℃，2 000 r/min，离心5 min。上清弃除。两管的沉淀即为心肌细胞，清洗细胞，细胞加入10 ml含10%FBA的DF12混悬，并加入双抗制得细胞悬液。接种于培养皿，置5%CO2，37℃培养箱中，90 min，进行差速贴壁以清除非心肌细胞。将培养液悬液(主要是心肌细胞)细胞计数。用含10%FBA的DF12调整细胞密度至5×105～1×106个/ml，并加入终浓度为 10－4mol/L溴脱氧核苷尿嘧啶(BRDU)，以抑制非心肌细胞培养。接种于培养板上。接种96孔板时细胞密度调整为1×105，接种24孔板、6孔板时细胞密度调整为1×106，48 h后换液。以后每2天换一次液，每日进行心肌细胞鉴定:倒置光学显微镜观察培养细胞的形态及心肌细胞跳动的频率。

1.2.2 实验分组 原代培养SD大鼠心室肌细胞，48 h后用8 mg/ml的D-半乳糖处理心肌细胞〔3〕制备模型，分为:对照组、模型组(终浓度8 mg/ml D-半乳糖)、模型+巴戟天组(终浓度8 mg/ml D-半乳糖+终浓度为0.5 mg/ml巴戟天)。诱导培养48 h后，停用半乳糖，模型组改用正常培养基换液，模型+巴戟天组改用含0.5 mg/ml巴戟天的正常培养基换液。各组继续培养5 d，模型组可得到衰老模型。进行各指标的检测。

1.2.3 药物制备 巴戟天提取物的制备〔5〕:称取巴戟天200 g，2 L双蒸水浸泡2 h。武火煮沸后，文火煮30 min，取药液。药渣再加入8倍量双蒸水浸泡2 h，武火煮沸后，文火煮30 min，取药液。将两次药液合并，纱布过滤，制得中药水煎液。90℃水浴浓缩至200 ml，即得到1 g/ml的药液。按体积比(中药∶乙醇=2∶3)加入无水乙醇，充分混匀，4℃冰箱静置过夜。次日，1 500 r/min，离心15 min，取上清(约 300 ml)。90℃水浴挥发乙醇，定容至 200 ml。即药液的终浓度为 1 g/ml。0.22 μm过滤器过滤除菌。－20℃保存待用。

1.2.4 衰老模型的评价 β-半乳糖苷酶活性是鉴定细胞衰老的一个生物学标志。随着细胞老化，在pH6.0的条件下，细胞内增高的β-半乳糖苷酶降解其底物X-半乳糖后，产生的蓝色产物也增多。药物处理后，即第10天，96孔板细胞进行β-半乳糖苷酶活性检测;MTT法测定细胞存活率。

1.2.5 测定指标和方法 α-MHC mRNA和β-MHC mRNA的表达检测:药物处理后，即第10天，抽提mRNA，RT-PCR方法检测α-MHC mRNA和β-MHC mRNA表达。α-actin蛋白表达的检测:第10天裂解细胞，抽提蛋白质并测定蛋白含量，蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，一抗(1∶200稀释)4℃冰箱孵育过夜，洗膜，二抗37℃条件孵育45 min，洗膜，电伪学发光(ECL)显影、曝光。RT-PCR及Western印迹图片均采用FR-200紫外与可见分析装置进行图像扫描及分析，RT-PCR结果以目的扩增产物与内参β-actin扩增产物的比值作为表达量，Western印迹结果以条带平均光密度(OD值)/3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(36 KD)作为表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件，数据资料以±s表示，组间比较采用t检验和χ2检验。

2 结果

2.1 原代细胞镜下变化 原代细胞培养第10天在倒置相差显微镜下观察，正常组细胞大多成簇连接，同簇搏动明显。而模型组大部分细胞仅以伪足相互连接成网，同簇搏动弱。巴戟天组细胞也大部分成簇连接，同簇搏动较模型组有所提高。见图1。

2.2 心肌细胞β-半乳糖苷酶活力及细胞活力 与正常组相比，模型组细胞内衰老特征性指标β-半乳糖苷酶活力显著性升高，且细胞活力明显下降(P＜0.05)，说明模型建立成功。而巴戟天组细胞内β-半乳糖苷酶活力相比于模型组显著下降(P＜0.05)，表明巴戟天较明显地抑制了衰老特征性指标β-半乳糖苷酶活力的上升;且细胞活力显著性升高(P＜0.05)，表明巴戟天提高了衰老细胞的活力。见表1。

2.3 电泳条带图像分析 与正常组细胞相比较，模型组α-MHC mRNA表达明显下降(P＜0.05);巴戟天组的α-MHC mRNA表达较模型组升高(P＜0.05)。表明巴戟天可一定程度上抑制衰老细胞α-MHCmRNA表达的降低。正常组β-MHCmRNA表达非常低;模型组β-MHC mRNA出现较高表达(P＜0.05);巴戟天组的β-MHC mRNA表达较模型组低(P＜0.05)，但远高于对照组，提示巴戟天虽然可抑制衰老细胞 β-MHC mRNA表达升高，但是不能完全修补D-半乳糖带给细胞的影响。见图2，表1。

表1 大鼠心肌细胞β-半乳糖苷酶、细胞活力、α、β-MHC mRNA(±s)

表1 大鼠心肌细胞β-半乳糖苷酶、细胞活力、α、β-MHC mRNA(±s)

与正常组相比:1)P＜0.05;与模型组相比:2)P＜0.05

组别β-半乳糖苷酶活力MTT α-MHC/β-actin比值β-MHC/β-actin正常组0.282±0.189 0.648±0.089 2.7±0.33 0.20±0.12模型组 0.694±0.1131)0.426±0.0881) 1.9±0.381) 1.21±0.341)巴戟天 0.428±0.0352)0.579±0.0502) 2.4±0.272) 0.82±0.532)

图1 原代细胞的镜下变化(×200)

2.4 细胞α-actin蛋白的表达 与正常组相比(0.364 7±0.028)，模型组、巴戟天组大鼠心肌细胞α-actin蛋白相对表达均无显著性变化〔(0.357 9±0.032)、(0.375 2±0.047)，P＜0.05〕。见图 3。

图2 大鼠心肌细胞α-MHC、β-MHC mRNA表达的电泳图

图3 大鼠心肌细胞α-actin的蛋白表达(Western印迹)

3 讨论

肌球蛋白是重要的骨架蛋白，是一个大分子六聚体，由两条重链(α-MHC和β-MHC)及四条轻链组成〔6〕。重链基因所编码的重型肌球蛋白具有ATP酶的活性，催化ATP分解释放能量，使心肌肌丝滑动收缩做功。研究表明α-MHC和β-MHC的比例是决定心脏收缩速度和收缩力的关键因素，以α-MHC为主的心脏比以β-MHC为主的心脏具有更强大的收缩力〔7〕。本实验结果显示衰老心肌细胞α-MHC mRNA水平较正常组下降，β-MHC mRNA表达上升，与以往的研究一致。这说明衰老可能通过降低α-MHC和β-MHC的比值降低了心肌的舒缩力。巴戟天组细胞α-MHC mRNA表达显著性上调，β-MHC mRNA表达显著性下调，提示出补肾益气药巴戟天可能通过调节肌球蛋白重链基因的表达提高衰老心肌的收缩力。

肌动蛋白可能是活性氧损伤的主要靶蛋白分子之一。在哺乳动物的心脏，可表达两种形式的α-actin:α-cardiac actin和α-skeletal actin。有报道两种α-actin在心肌衰竭发展不同阶段表达不同，但是也有报道指出，心肌组中总α-actin的水平是受严格控制的〔8〕。本研究大鼠心肌总α-actin的表达各组均恒定，是否衰老也许对肌动蛋白并没有损伤作用，或者是心肌中α-actin的两种形式当一种表达降低时，另外一种会协调性的增加，但总水平恒定，有待进一步探讨。

1 沈景霞，修春红，樊 英，等.心肌组织多普勒速度显像定量评价健康老年人心室功能〔J〕.中华老年医学杂志，2005;24(2):85-8.

2 赵保路.自由基、营养、天然抗氧化剂与衰老〔J〕.生物物理学报，2010;26(1):26-36.

3 王 琳，丁秀云，刘谟焓，等.D-半乳糖对幼鼠心肌细胞拟衰老作用的实验〔J〕.中国临床康复，2005;9(39):25-7.

4 许 浩，葛亚坤，邓同乐，等.人参皂苷Rb1对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的保护作用〔J〕.中国药理学通报，2005;21(7):803-6.

5 张贺鸣，韩联合，冯国清，等.巴戟天对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的防护作用〔J〕.河南中医学院学报，2005;20(3):20-1.

6 魏 岚，王 玲.心肌收缩蛋白的结构与功能研究进展〔J〕.生物医学工程学杂志，1997;14(3):299-308.

7 童普德，王晓玲，胡旭东，等.延衰中药补肾益精方对大鼠左心室α、β-MHC mRNA增龄变化的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2001;7(4):34-6.

8 Buttrick P，Malhotra A，Factor S，et al.Effect of aging and hypertension on myosin biochemistry and gene expression in the rat heart〔J〕.Circ Res，1991;68(3):645-52.