补肾方药对老年大鼠血清皮质酮含量、LTP及空间学习记忆能力的影响

康湘萍 金国琴 董献文 龚张斌 徐品初 (上海中医药大学基础医学院生物化学教研室，上海 003)

衰老是生物界普遍存在的一种自然现象，在衰老的进程中，机体出现各种生理功能下降或紊乱，其中最显著的特征之一是增龄性的学习记忆能力减退。有关衰老尤其是脑老化的机制学说有很多，根据本课题组前期的研究〔1〕及近年来国内外的实验表明〔2，3〕，糖皮质激素(GC)的细胞毒性作用与衰老相关的认知能力降低密切相关。衰老过程中下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能失调可引起GC分泌过多，反馈作用于海马区域的糖皮质激素受体(GCR)，对海马结构和功能产生毒性作用，从而导致学习记忆能力的减退。中医认为“肾藏精，主骨生髓”，肾精虚衰在衰老中具有重要地位。故本实验以中医衰老肾虚理论为指导，以自然衰老大鼠为动物模型，采用ELISA法、电生理技术及Morris水迷宫法观察补肾方药(左归丸、右归丸)对老年大鼠血清皮质酮含量、LTP及空间学习记忆能力的影响，以进一步探讨补肾方药改善老年人认知障碍的作用机制，为临床运用该方药延缓衰老提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 左归丸和右归丸用《景岳全书》原方。左归丸由熟地黄20 g、山药10 g、菟丝子10 g、枸杞子10 g、山茱萸10 g、牛膝7.5 g、龟板胶10 g、鹿角胶10 g组成;右归丸由熟地黄 24 g、山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、杜仲12 g、当归9 g、肉桂6 g、附子6 g组成，以上药物均购自上海康桥中药饮片有限公司。将各方药按传统方法水煎成剂，并加以浓缩，－30℃保存，临用前稀释饮用。

1.2 实验动物造模及分组 12月龄雄性SD大鼠，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供〔动物许可证号:SCXK(沪)2008-0016〕。随机分为4组:老年对照组、老年GC拮抗组、老年左归组和老年右归组，另设青年对照组。自21月龄起分别给老年左归组及老年右归组大鼠饮用左归丸和右归丸药液(剂量相当于临床成人每公斤体重剂量的10倍)，连续3个月，每周饮药液5 d，停药2 d;老年GC拮抗组于水迷宫及LTP实验前2 ～3 h，皮下注射 RU38486(5 mg/kg)〔4〕。

1.3 试剂与仪器 血清皮质酮ELISA试剂盒(美国ADL公司)，Morris水迷宫测试分析软件(荷兰Noduls公司)，江湾ⅠC型脑立体定位仪(上海川沙花木农机厂)，Escort-Ⅲ牙科钻(韩国SAEYANG公司)，RM6240型生物信号采集系统(成都仪器厂)。

1.4 空间学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫法〔5〕。实验前动物自由游泳2 min。平台设于迷宫西南象限正中(训练期间平台位置固定)，水面高出平台1.5 cm，水温保持在19℃ ～20℃。大鼠连续训练5 d，每天2次，分别从正北、正东两个起始点投放，设定最长游动时限为70 s，电脑自动计时，记录大鼠找到平台所需要的时间，即潜伏期(s)。如果大鼠70 s内未能找到平台，潜伏期记为70 s;同时将其引至平台上，在平台上停留20 s。记录每天各组大鼠两次潜伏期的时间(s)，取均值进行统计学评价。

1.5 海马CA1区LTP的检测〔6〕

1.5.1 电极安装与定位 大鼠以20%乌拉坦(1.5 g/kg)麻醉，并固定于立体定位仪上。常规手术暴露颅骨，参照大鼠脑立体定位图谱确定记录电极及刺激电极的坐标定位:记录电极位于CA1区辐射层，坐标为前囟后3 mm，旁开2.5 mm，深度根据场电位特征，一般约为2 mm左右;刺激电极位于同侧海马CA3 Schaffer侧支处，坐标为前囟后4.2 mm，旁开3.8 mm，深度根据刺激诱发波形调整，一般约为3.8 mm左右。在上述坐标部位钻直径为1.5 mm的小孔，分别埋置记录电极及刺激电极，调整刺激电极和记录电极的位置，找到以固定强度的刺激记录到最大的群峰电位(PS)时将电极固定。以上操作均在屏蔽笼内完成。

1.5.2 基础对照记录和LTP的诱导 测试刺激由电子刺激器产生，单刺激采用高级刺激模块中的自动多串刺激。参数:波宽0.1 ms，脉冲数1个，刺激强度为最大诱发波所用刺激强度的1/3，一般为5 V左右，循环60次，循环间隔为30 s。待上述基础记录稳定30 min后，再给予可以诱发LTP的高频刺激(HFS)。具体刺激方案为:串单刺激，波宽0.1 ms，波间隔10 ms，延时20 ms，脉冲100个，所用刺激强度与单刺激相同。HFS后用上述单刺刺激进行检测，如果PS幅度较自身对照值增加30%以上且持续时间超过30 min，则表明LTP现象已经形成，连续观察记录60 min。

1.5.3 数据分析处理〔7〕每次测试单次刺激均可诱发出1个PS，将连续10个PS幅值叠加处理后的平均值作为一个时间点的PS幅值。以HFS前记录的6个时间点的PS幅值的平均值作为自身基础幅值，HFS后每个时间点的PS幅值与之比较得出的相对值(%)表示。

1.6 血清皮质酮含量的测定 大鼠麻醉后于腹主动脉取血，置于离心管内，室温下3 000 r/min，离心10 min，取上清液置于－80℃冰箱保存。采用ELISA法检测皮质酮含量，按说明书操作，美国BIO-TEX全自动酶标仪(ELX800)检测吸光度，吸光度的检测波长为450 nm。

1.7 统计学处理 采用SPSS12.0软件，所有数据均以±s表示，组间比较采用t检验;水迷宫检测数据采用重复测量数据的方差分析方法进行统计〔8〕。

2 结果

2.1 补肾方药对老年大鼠空间学习记忆能力的影响 各组大鼠随着训练次数的增多，找到平台所需的时间(潜伏期)呈逐渐缩短趋势。从训练的第2天起，老年对照组大鼠潜伏期较青年对照组明显延长(P＜0.05)，老年左归组较老年对照组潜伏期显著缩短(P＜0.05);从第3天起，老年右归组和老年GC拮抗组大鼠潜伏期较老年对照组亦明显缩短(P＜0.05)。提示老年大鼠空间学习记忆能力逐渐减退，补肾方药左归丸、右归丸及拮抗剂Ru38486对衰老大鼠的空间学习记忆减退均有一定的改善作用。见表1。

2.2 补肾方药对老年大鼠HFS诱导LTP的影响 与青年对照组比较，老年对照组大鼠海马CA1区LTP受到明显抑制(P＜0.05)，左归丸能显著减轻该抑制作用;右归丸从HFS诱导LTP后的第20分钟开始，亦可显著改善该抑制作用(P＜0.05);拮抗剂RU38486对LTP的抑制作用存在一定的改善趋势，除第50分钟时存在显著性差异外，其余各时段差异无统计学意义。见图1。

2.3 补肾方药对老年大鼠血清皮质酮含量的影响 老年对照组大鼠血清皮质酮(ng/L)含量(195.13±10.80)较青年对照组(71.89±7.63)明显升高(P＜0.05)，老年GC拮抗组(82.55±7.71)和老年左归组(141.61±8.86)大鼠血清皮质酮含量(141.59±15.29)较老年对照组显著降低(均P＜0.05)，老年右归组大鼠血清皮质酮含量相对老年对照组有降低趋势，但是无统计学意义(P＞0.05)。提示老年大鼠体内存在高皮质酮现象，而补肾方药及RU38486对该现象存在一定的改善作用。

表1 补肾方药对老年大鼠空间学习记忆能力的影响(±s)

表1 补肾方药对老年大鼠空间学习记忆能力的影响(±s)

与青年对照组比较:1)P＜0.05;与老年对照组比较:2)P＜0.05

组别 n潜伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年对照组 10 64.5±7.34 55.7±9.37 42.3±8.49 33.6±7.52 24.7±4.97老年对照组 10 70.0±0.00 68.8±2.571) 65.0±6.111) 63.0±6.061) 60.4±7.041)老年GC拮抗组 10 68.1±4.33 61.2±7.51 53.4±5.952) 46.6±3.862) 42.2±3.552)老年左归组 10 67.1±4.50 58.8±8.382) 51.6±6.382) 45.3±4.832) 39.8±3.292)老年右归组 10 68.9±2.33 60.2±8.39 49.5±3.372) 42.7±3.232) 39.7±2.502)

图1 补肾方药对HFS诱导大鼠海马CA1区LTP的影响

3 讨论

随着衰老，学习记忆能力逐渐下降，随之产生的各种与此相关的老年性认知缺陷和障碍疾病严重影响老年人的生存质量，也给社会家庭带来沉重的负担。据联合国的预测〔9〕，到2010年，中国60岁及65岁以上人口比分别为12.3%和8.1%，2020年更将达到16.7%和11.5%，表明我国已经进入人口老龄化国家行列。因此，研究衰老时学习记忆减退的机制，寻找预防老年智力退化的药物是当前医药界面临的一个重要任务。

众所周知，学习记忆的神经生物学基础是神经细胞之间突触的可塑性变化，而海马是最早被认为在学习记忆过程中起关键作用的中枢结构〔10〕。1973年 Bliss等〔11〕首次记录到长时程突触传递增强现象(即LTP);在此基础上，越来越多的资料显示〔12，13〕，LTP是研究学习和记忆的神经元可塑性的最好模型，可能是学习和记忆的神经基础，并作为神经科学研究当中衡量突触可塑性的一个主要的电生理指标。Morris水迷宫则是检测大鼠空间学习记忆的常用装置，其检测到的记忆是一种空间参考记忆;从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆属于陈述性记忆，而临床健忘和痴呆的病人，正是陈述性记忆受损明显。在Morris水迷宫和LTP实验中笔者观察到老年大鼠空间学习记忆明显减退，其海马CA1区LTP同样受到明显抑制，而左归丸、右归丸及皮质酮受体拮抗剂RU38486均不同程度地对老年大鼠神经元可塑性的退行性变化有一定的改善作用。

大脑边缘系统——海马在衰老进程中是最易受到影响的脑区之一，与学习记忆能力退化密切相关〔14〕。导致这种变化的原因之一可能是长期的高浓度糖皮质激素(GC)对它的损害作用〔15〕，因为海马区域含有丰富的GC受体，这就使得海马区域成为老年性高水平皮质激素毒性的重要靶位。有研究表明，在人类或者啮齿类动物的正常老化过程中可以观察到一系列HPA负反馈作用减弱的表现，诸如糖皮质激素的基础水平增高，海马萎缩以及认知障碍〔16，17〕，虽然糖皮质激素水平增高并非年龄老化的一个恒定特征，但确实与衰老加速过程中的认知功能减退相关〔17〕。本文的研究结果表明，老年大鼠血清皮质酮含量较青年对照组明显升高，补肾方药左归丸、右归丸能不同程度降低老年大鼠异常增高的皮质酮水平，减轻皮质酮对于海马的毒性作用，改善老年大鼠的学习记忆能力;同时，皮质酮受体拮抗剂RU38486同样能够显著降低老年大鼠血清皮质酮含量，提高老年大鼠的学习记忆能力，推测可能与其减弱GC对海马神经细胞GCR的毒性作用有关〔15，18〕。

从中医的角度来看，老年性学习记忆的减退属于“呆症”和“健忘”范畴，其病位在脑而本于肾。肾藏精生髓，脑为髓之海。肾强髓充则元神精湛而记忆不怠;髓海不足，脑失充养，则神明呆滞而引起学习记忆功能减退甚至障碍。清代王清任说:“人之灵机记忆皆在脑”，表明肾与脑的记忆功能关系密切。左归丸和右归丸是明代张景岳根据阴阳互根原理研制的“滋补肾阴”和“温补肾阳”的经典补肾方药〔19〕，二方皆可通过补肾益髓之功改善老年性学习记忆减退的表现，究其作用机制，可能与拮抗高浓度皮质酮对海马神经元的损伤有关，深入的分子机制有待于进一步的研究。

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10 Chong HW，Liu JX，Xu L.Effect of combination of extracts of ginseng and ginko biloba on neurotransmitters in whole brain of β-amyloid peptide(1-40)treated rat〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2006;22(6):747-50.

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19 喻 嵘.明清医家对张景岳阴阳互济及其左归丸和右归丸的探析〔J〕.中国中医基础医学杂志，2000;6(3):3-6.