IFN-α对老年女性丙型病毒性肝炎患者Th1/Th2型细胞因子的影响

刘 平 李建团 穆怀畅 刘金霞 (承德医学院，河北 承德 067000)

干扰素-α(IFN-α)联合病毒唑是目前常用的也是较为有效的治疗慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)的方法。然而，其骨髓抑制、抑郁、甲状腺功能异常等严重不良反应，常影响患者的依从性和治疗效果，尤其在老年女性患者，甲状腺功能减退发生率明显高于男性和青年患者〔1〕，甚至发生老年抑郁。本研究通过检测CHC患者应用IFN-α过程中外周血单个核细胞内辅助性T细胞亚群(Th1/Th2)细胞因子的表达水平，探讨IFN-α对Th1/Th2细胞因子表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2006～2008年在我科门诊或住院病房行IFN治疗的54例CHC患者，其中男30例，女24例;年龄18～65〔平均(35.6±16.8)〕岁。在男性患者中，50～65岁15例设为老年男性组;在女性患者中，50～65岁13例设为老年女性组;18～50岁26例设为中青年组。既往无精神疾病及其他身心疾病等遗传疾病史。治疗前进行血、尿常规、肝功能、丙肝病毒(HCV)抗体、HCV RNA、甲状腺功能、肾功能、血糖、自身免疫相关项目等详细检查，严格按照中华人民共和国卫生行业标准《丙型病毒性肝炎诊断标准及处理原则》选择研究对象，排除其他肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)感染〔2〕。另外选择同期体检的正常人血清20人份，作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 应用聚乙二醇(PEG)-IFNα-2a 180 μg，每周1次，皮下注射。治疗过程中严密监测患者用药后不良反应，出现自身免疫病、骨髓抑制等严重不良反应需被迫停药者，排除在统计分析范围内。所有病例在应用IFN外均应用相似的保肝降酶治疗药物，在治疗观察期间没有服用其他对甲状腺水平有影响的药物，饮食等。用药时间48 w。

1.2.2 标本留取 分别在治疗前和治疗12 w时空腹抽取患者静脉血10 ml，分离外周血单个核细胞，液氮中保存，备用。

1.2.3 Th1/Th2细胞因子检测 采用细胞总RNA提取Trizol试剂试剂盒，严格按操作指南提取总RNA，核酸蛋白分析仪测定提取总RNA的浓度，应用2 μg总RNA，在20 μl体系中合成cDNA第一条链，体系如下:10× buffer2μl，2.5mmol/LdNTP0.25 μl，Oligo(dT)15 primer 1 μl，M-MLV 200 U，RNA 酶抑制剂0.5 μl，42℃ 1 h，92℃ 5 min，灭活逆转录酶。β-肌动蛋白(β-actin)、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10引物由上海生工合成，见表1。用所得cDNA进行RT-PCR 反应，扩增内参照 β-actin 及 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10的PCR反应条件见表1〔3〕。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶显色，凝胶成像系统进行照相，Gel-PRO ANALYZER凝胶定量分析软件进行灰度分析，得β-actin及4种细胞因子灰度值，将4种细胞因子灰度值分别除以β-actin灰度值，从而得到4种细胞因子相对含量(%)。

表1 PCR引物、扩增片段大小及扩增条件

1.3 统计学方法 应用SAS8.0统计软件，数据资料以±s表示，采用t检验。

2 结果

2.1 CHC患者治疗前与正常对照组Th1/Th2细胞因子表达水平的比较 CHC患者与正常对照组比较，Th1细胞因子表达水平较低，而Th2细胞因子表达水平偏高。见表2。

2.2 CHC患者治疗12 w后与正常对照组Th1/Th2细胞因子表达细胞因子水平比较 IFN治疗12 w后，各组患者之间进行比较，发现老年女性组Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α表达水平明显升高，与老年男性组和正常对照组比较差异有统计学意义，但与中青年组比较差异无统计学意义，甚至IFN-γ显著降低。见表2。

2.3 CHC治疗前后各组Th1/Th2细胞因子表达水平的变化 IFN-α联合病毒唑治疗12 w时Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平显著增高，Th2类细胞因子IL-4和IL-10的表达水平与治疗前相比无显著性变化。见表2。

表2 CHC患者治疗前和治疗12 w后Th1/Th2表达水平的变化(± s，%)

表2 CHC患者治疗前和治疗12 w后Th1/Th2表达水平的变化(± s，%)

与治疗前比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与老年女性组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与正常对照组比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01;与老年男性组比较:7)P＜0.05

组别 n IFN-γ治疗前 治疗后TNF-α治疗前 治疗后IL-4治疗前 治疗后IL-10治疗前 治疗后正常对照组 20 27.29±5.26 － 24.13±3.55 － 10.0 7±3.33 － 15.52±3.21 －老年女性组 13 19.97±3.256)24.34±5.371)5)18.99±2.386)29.34±5.322)6)8.37±1.695) 9.38±2.38 13.64±3.65 14.30±3.25老年男性组 15 18.31±4.286)22.35±3.562)3)6)21.35±5.245)26.66±3.292)5)10.37±2.054) 9.68±2.25 12.37±2.696) 13.98±2.54中青年组 26 25.54±3.873)7)28.34±3.452)4)22.35±3.843)28.39±4.382)6)12.39±3.264)5)13.34±2.974)6)11.37±3.034)6)13.04±3.085)

3 讨论

CD4+T细胞在宿主抗病毒的免疫应答中发挥重要作用，根据细胞因子分泌模式的差异，可分为Th1、Th2两类。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，参与细胞免疫反应;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，参与体液免疫反应。IFN在发挥抗病毒治疗过程中，能够激起强的Th1和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，则病毒被清除;而弱的Th1反应常伴随着病毒的持续感染和治疗失败〔4，5〕。然而，与此同时，伴随着Th1和Th2细胞因子诱导的免疫反应相互抑制、相互调节，处于动态平衡状态被打破，机体不能维持正常的细胞免疫和体液免疫功能。IFN-γ主要由Th1细胞产生，可上调甲状腺滤泡细胞主要组织相容抗原大分子的表达，介导细胞免疫，促进甲状腺内淋巴细胞浸润，并使浸润的淋巴细胞和巨噬细胞激活并释放IFN-α、IL-1、IL-6等细胞因子及产生氧自由基，从而造成甲状腺组织的破坏。IL-4主要产生于Th2细胞，可促进IgG2、IgA和IgE等抗体的产生，介导体液免疫，最终发生自身免疫性疾病〔6〕。

在本研究中，使用半定量RT-PCR方法，从基因表达水平检测Th1/Th2平衡的变化，即用外周血单核细胞中相对恒量表达的β-actin为内参照，将细胞因子基因与β-actin基因同时进行PCR扩增后，根据细胞因子基因与β-actin基因扩增产物量的比值估算细胞因子基因的相对含量。该方法能够精确地反映机体免疫功能受到的调节。检测结果发现，在抗病毒治疗前，老年女性CHC患者IFN-γ、TNF-α的表达均明显低于正常对照组、老年男性组和中青年组。提示CHC患者的细胞免疫功能下降，病毒清除能力减弱，这可能是造成HCV持续感染的原因之一。对IFN-α联合病毒唑治疗12 w时的患者进行分组分析，发现老年女性组Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平显著增高。提示抗病毒治疗充分激活了完全应答组的Th1型免疫反应，患者的细胞免疫功能得到恢复，并因此获得了良好的治疗效果。

1 王欣怡，张学敏，张文彬，等.干扰素致老年丙型肝炎患者抑郁与甲状腺功能低下的关系〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(9):1194-5.

2 彭文伟.传染病学〔M〕.第5版.北京:人民卫生出版社，2001:15-45.

3 Tsai SL，Sheen IS，Chien RN，et al.Activation of Th1 immunity is a common immune mechanism for the successful treatment of hepatitis B and C:tetramer assay and therapeutic implications〔J〕.J Biomed Sci，2003;10(1):20-35.

4 Abayli B，Canataroglu A，Akkiz H.Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Tark J Gastroenterol，2003;14(1):7-11.

5 Aghemo A，Rumi MG，Colombo M.Pegylated IFN-alpha2a and ribavirin in the treatment of hepatitis C〔J〕.Expert Rev Anti Infect Ther，2009;7(8):925-35.

6 张文彬，王欣怡，刘金霞.聚乙二醇干扰素致老年女性丙型病毒性肝炎患者抑郁症状分析〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(11):1495-6.