EL9611红白血病小鼠急性GVHD动物模型的建立*

纳 宁， 何善阳， 徐 霖， 陈 康， 赵 湛， 廖 冰， 曹开源

(1中山大学附属第三医院肾移植科，广东 广州 510630;2中山大学第一附属医院黄埔院区妇产科，广东 广州 510700;3中山大学热带病防治研究教育部重点实验室，广东广州 510080;4东莞市中医院神经内科，广东东莞 523000;3中山大学中山医学院病理学教研室，广东广州 510080)

移植物抗宿主病(graft－versus－host disease，GVHD)是同种异体骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo－BMT)后最主要的并发症之一，它的发生严重影响着移植后的生存时间和生存质量。GVHD的发生主要是由于植入的供者免疫活性细胞识别受者的移植抗原，产生细胞免疫和体液免疫反应，使受者的组织细胞受到免疫反应的攻击而受损，可累及全身多个组织器官，严重时可致病人死亡，其中皮肤、肝脏和胃肠道是最主要的受损器官。本课题组近年来致力于不成熟CD8α+树突状细胞(dendritic cells，DCs)诱导免疫耐受的研究，已成功建立起不成熟CD8α+DC的体外诱导培养体系［1－3］，并通过体外实验证明其具有分泌高水平白细胞介素10(interleukin－10，IL－10)，抑制同种混合淋巴细胞反应的作用［4］，但其体内防治GVHD的功能尚有待进一步证实。因此，本研究通过建立小鼠EL9611红白血病和急性GVHD动物模型，并通过临床表现、病理改变和生存时间等指标评估动物模型的可靠性，为不成熟CD8α+DC防治急性GVHD和保留移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)的研究打下坚实基础。

材料和方法

1 动物

4－6周雄性 SPF级 C57BL/6小鼠(合格证号为0017563)，4－6周雄性 SPF级 BALB/c小鼠(合格证号为0013056)，均由中山大学实验动物中心提供。所有GVHD及红白血病模型鼠(BALB/c鼠)均饲养于中山大学实验动物中心SPF实验环境中(动物实验设施使用证号为0006523)。EL9611红白血病细胞株购自天津中国医学科学院血液学研究所。

2 EL9611红白血病动物的传代［5］

采用体内传代的方法，无菌条件下取红白血病BALB/c小鼠脾脏，剪碎后经不锈钢滤网过滤，PBS洗涤1次，离心去上清，加入0.15 mol/L NH4Cl红细胞裂解液处理，洗涤2次，计数。尾静脉注射白血病鼠脾细胞2×106个/鼠建立EL9611红白血病动物模型。观察小鼠的存活时间、肝脾称重并进行病理检查，发病晚期镜下计数外周血白细胞(white blood cell，WBC)数目，并涂片进行Giemsa染色镜检。当外周血WBC＞3.0×1010/L时拉颈处死，取脾细胞传代。

3 同种异基因骨髓移植(allo－BMT)［6］

以allo－BMT当天为第0 d，EL9611红白血病鼠第－7 d每只小鼠接种2×106白血病细胞;第－5 d开始，饮用水中添加庆大霉素320 mg/L和红霉素250 mg/L;第0 d进行1次性全身致死剂量的［60Co］γ射线照射治疗，照射剂量8.0 Gy;照射后5 h内进行骨髓移植，每只小鼠经尾静脉输注同种异基因C57BL/6(H－2b)小鼠骨髓细胞2×106+脾细胞1×107，输注总剂量0.5 mL/只。移植后第3 d撤去红霉素和庆大霉素，观察小鼠临床表现，包括:精神状态、活动能力、体位改变、皮毛、体重、大便等，记录每只小鼠的生存时间、计算存活率并绘制生存曲线。病理检查濒死小鼠的皮肤、肝脏、小肠。

4 实验分组

白血病组:n=10，第－7 d每只小鼠尾静脉输注2×106白血病细胞，不进行［60Co］γ射线照射，尾静脉输注PBS 0.5 mL。照射对照组:n=4，第－7 d每只小鼠尾静脉输注2×106个EL9611细胞，经1次［60Co］γ射线8.0 Gy照射，照射后不进行allo－BMT，尾静脉输注PBS 0.5 mL，照射后第7 d开始每天计数WBC。GVHD组:n=10，第0 d进行1次8.0 Gy的［60Co］γ射线照射，照射后进行allo－BMT，建立EL9611白血病鼠的急性GVHD模型。正常对照组:n=4，正常BALB/c小鼠未进行照射，第0 d尾静脉输注PBS 0.5 mL。

5 病理学检查

各组织经常规10%甲醛－PBS固定、石蜡切片、HE染色检查。白血病组进行肝、脾HE染色，血涂片行Giemsa染色观察。照射对照组取濒死鼠的股骨进行骨髓病理切片和HE染色。GVHD组进行肝、皮肤、小肠的组织切片和HE染色;以正常对照组小鼠相应的组织切片作为正常对照。

6 统计学处理

结 果

1 EL9611红白血病动物模型的建立

接种2×106个白血病细胞的EL9611红白血病鼠平均生存时间为(14.5±2.1)d，死亡率100%，无自发缓解，死亡时肝脾肿大，肝重(2.40±0.48)g，脾重(0.84±0.20)g，与正常对照组［肝(1.05±0.15)g，脾(0.07±0.01)g］相比P＜0.01。外周血WBC升高，死亡前1－2 d WBC计数为(3.33±0.27)×1010/L，与正常对照组［(1.37±0.23)×1010/L］相比，P＜0.05。外周血涂片中可见异形白血病细胞，肝脾病理检查示脾脏正常结构被破坏，弥漫性白血病细胞浸润，核分裂相与凋亡相较多，肝脏中有大量白血病细胞浸润灶，见图1A－C，结果符合文献报道EL9611红白血病的表现［5］。

Figure 1.The pathological analysis in leukemia group and radiation control group.Mice in leukemia group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells via tail vein on day－7.Mice in radiation control group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells on day－7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0 without allo－BMT.A:liver of mice in leukemia group(HE staining，×400);B:spleen of mice in leukemia group(HE staining，×400);C:peripheral blood of mice in leukemia group(Giemsa staining，×800);D:bone marrow of mice in radiation control group(HE staining，×100).图1 白血病组和照射对照组小鼠的病理表现

2 EL9611红白血病鼠急性GVHD模型的建立

照射对照组经照射后外周血白细胞进行性下降，第8 d以后WBC降为0，出现皮下出血等凝血功能下降症状，骨髓病理显示无造血增生，骨髓被脂肪组织取代，表明死于造血衰竭，8.0 Gy为致死性照射剂量，见图1D。GVHD组小鼠移植10－13 d后开始出现消瘦，死亡时体重(11.00±0.97)g，与正常对照组(15.60±1.90)g相比，P＜0.05，以及弓背、竖毛、精神萎靡、皮毛脱落、腹泻等典型的GVHD临床症状［6］，病理检查显示皮肤角化不良，表皮与真皮之间出现裂隙，交界处血管充血，真皮层炎症细胞浸润;肝脏中央静脉充血，汇管区炎症细胞浸润;小肠可见肠黏膜上皮细胞脱落，黏膜下层炎症细胞浸润，其病理表现符合Ⅰ到Ⅱ度GVHD的改变，未见白血病征象，见图2。

3 各组小鼠生存时间分析

未进行BMT的照射对照组TBI后外周血WBC进行性减少，第8 d以后降为0，出现皮下出血等血小板减少征象，平均生存时间为(9.00±0.71)d，生存时间与GVHD组及正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，死亡率100%;未照射的白血病组平均生存时间为(7.50±0.65)d(以照射当天为第0 d)，生存时间与GVHD组及正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，死亡率100%;GVHD对照鼠平均生存时间为(32.00±3.17)d，生存时间与其它各组相比差异显著(P＜0.01)。各组的生存曲线见图3。

Figure 2.The pathological analysis and appearance of mice in GVHD group.Mice in GVHD group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells on day －7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0，then received allo－BMT of 2×106C57BL/6 bone marrow cells+1 ×107C57BL/6 spleen cells.A:skin(HE staining，×400);B:liver(HE staining，×400);C:small intestine(HE staining，×400);D:clinical manifestation of hunched back and depilation 10－13 d after allo－BMT.图2 GVHD组的病理和临床表现

Figure 3.The survival curve analysis among different groups.Mice in leukemic group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemia cells via tail vein on day－7.Mice in radiation control group received EL9611 leukemia cell infusion on day －7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0 without allo－BMT.Mice in GVHD group received EL9611 leukemia cell infusion on day－7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0，then received allo－BMT of 2×106C57BL/6 bone marrow cells+1 ×107C57BL/6 spleen cells.图3 各组小鼠的生存分析

讨 论

GVHD的发生严重影响骨髓移植患者术后的生存时间和生存质量。如何在防治GVHD的同时保留移植物抗感染和GVL效应已成为临床上开展骨髓移植和治疗白血病需要解决的难题之一。耐受性DCs为GVHD的防治提供了新的思路［7，8］。本课题组近年来已成功建立了不成熟CD8α+DCs的体外培养方法［1－3］，体外实验已证明所诱导的 CD8α+DCs具有抑制混合淋巴细胞反应的功能［4］，但其体内功能仍需进一步确证。建立白血病小鼠的GVHD动物模型是研究GVHD尤其是GVL效应机制和防治研究的重要基础，但目前国内对于GVL效应机制的研究很少，未见相关动物模型的报道，因此，本研究建立了白血病小鼠的GVHD动物模型，为不成熟CD8α+DC防治GVHD和GVL效应的研究提供实验条件。本研究所选取的EL9611红白血病模型是国内建立的可移植性白血病动物模型，白血病细胞主要侵及骨髓、脾及肝脏，晚期外周血中可见大量瘤细胞，对常用化疗药物敏感，是较理想的动物模型之一［5］。目前国内尚无白血病联合GVHD动物模型建立的报道，而国外白血病和GVHD小鼠模型的建立常采用 C1498、A20、P815 等细胞株［9，10］，未见应用红白血病细胞株来建GVHD动物模型的报道，采用EL9611红白血病细胞株建立起来的白血病GVHD动物模型国内外更是未见相关报道。本研究中，接种2×106个白血病细胞的白血病组平均生存时间为(14.5±2.1)d［以照射当天为第0 d，则为(7.5±0.7)d］，死亡率100%，无自发缓解，死亡时肝脾肿大，外周血WBC升高(P＜0.05)，病理检查证实外周血中出现多量体积大、核异形的白血病细胞，并可见核分裂相，肝脾中均有大量白血病细胞浸润，易见凋亡相与核分裂相，正常组织被破坏，符合白血病的病理改变［5］(图1A－C)，表明EL9611红白血病模型建立成功。本研究选在传代7 d后即白血病的中期进行allo－BMT，照射前饮用水中添加红霉毒与庆大霉素预防TBI后发生严重感染。由于小鼠较人类易于诱导免疫耐受，单纯骨髓移植往往难于诱导出致死性GVHD，可能出现部分小鼠的GVHD症状自发缓解而长期存活的现象，病理改变也较轻，致死性GVHD病理检查常不过是Ⅰ－Ⅱ度，难以产生如同人类的Ⅲ－Ⅳ度的病理改变。因此，诱导出致死性的、症状典型的GVHD往往需要同时添加成熟淋巴细胞才能实现［6］。本研究中采用TBI后每只受鼠静脉输注同种异基因供鼠骨髓细胞2×106+脾细胞1×107的方法建立GVHD的动物模型。照射对照组在TBI后外周血WBC进行性减少，第8天以后降为0，出现皮下出血等血小板减少征象，平均生存时间为(9.00±0.71)d，死亡率100%，病理检查证实骨髓造血衰竭(图1D)，表明8.0Gy的照射剂量是致死性的合适剂量。GVHD组在移植后10－13天开始出现精神萎靡、消瘦、弓背、竖毛、脱毛(严重时出现表皮结痂脱落)、腹泻等GVHD的临床症状(图2)，与文献报道的典型症状一致［6］，死亡率100%，病理检查显示皮肤、肝脏、小肠的病理表现符合Ⅰ到Ⅱ度GVHD的改变(图2)，未见白血病细胞浸润，生存期(32.00±3.17)d与照射对照组及白血病组相比均差异显著(P＜0.01)，表明TBI加allo－BMT可以产生抗白血病的治疗作用，allo－BMT可延长照射后小鼠的存活时间并恢复造血。以上实验结果表明EL9611红白血病鼠的急性GVHD动物模型建立成功，为GVHD防治和GVL效应的进一步研究打下了坚实的基础。

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