血管紧张素Ⅱ和血管紧张素－(1－7)对大鼠血管平滑肌细胞肾素(原)受体表达的影响*

张娜娜， 李茂莲， 边云飞， 高 奋， 杨志明， 杨慧宇， 肖传实

(山西医科大学第二医院心内科，山西 太原 030001)

肾素－血管紧张素系统(renin－angiotensin system，RAS)是机体维持正常血压、水电解质平衡的重要系统。近年来，随着越来越多生物活性血管紧张素肽以及与这些肽相互作用受体的发现，肾素血管紧张素系统越来越复杂。2002年Nguyen等［1］首次报道人肾素(原)受体［(pro)renin receptor，(P)RR］的存在，并且克隆了该受体。(P)RR在人体内广泛分布，免疫细胞化学研究表明，(P)RR主要分布在远端肾小管、肾小球系膜区、肾和冠脉血管的平滑肌细胞、新生大鼠的心肌细胞、人脐静脉内皮细胞及人的单核细胞。自从(P)RR被发现以来，关于(P)RR在肾脏和心脏中的生理及病理作用越来越受到重视，特别是在糖尿病肾病和心肌梗死发病中的研究［2－4］。大量研究发现RAS参与了动脉粥样硬化的发病过程［5，6］，抑制 RAS对治疗心血管疾病具有良好效果。而血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang II)是RAS中的主要活性物质，血管紧张素－(1－7)［angiotensin－(1－7)，Ang－(1－7)］是 AngⅠ和 AngⅡ转化而成的7肽生物活性物质，近年来研究发现其在许多方面与AngⅡ有着相拮抗的作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管组成的主要细胞，在动脉粥样硬化形成、高血压和血管再狭窄等疾病中起重要作用，故本研究将观察AngⅡ和Ang－(1－7)对VSMCs(P)RR的调节，并进一步探讨其机制。

材料和方法

1 材料

细胞培养基 DMEM、胎牛血清购自 Hyclone;A7r5细胞株购自上海中科院细胞库;胰蛋白酶、AngⅡ、Ang－(1－7)和renin为Sigma产品;RNA抽提试剂盒购自Gibco;逆转录试剂盒购自MBI;内参照物GAPDH和(P)RR购自上海生工生物工程技术服务有限公司。SYBR Premix Ex TaqTMII购自TaKaRa，(P)RR单克隆抗体购自Sigma，辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG购自Cell Signaling Technology，其它试剂均为国产分析纯。

2 大鼠VSMCs的培养

A7r5细胞株用含20%FBS的DMEM培养基培养，培养瓶中置于5%CO2、37℃培养箱内培养，待细胞生长达亚融合状态时，以0.25% －EDTA胰蛋白酶消化、传代。选择生长良好的第2－5代细胞用于实验。

3 实验分组

将生长在6孔培养板上和50 mL培养瓶中无血清静止培养6 h的VSMCs培养液，按以下分组加入不同干预因素进行实验。(1)对照组:不加干预因素;(2)不同浓度AngⅡ组:分别加入AngⅡ10、100、1000 nmol/L;(3)不同浓度Ang－(1－7)组:分别加入Ang－(1 －7)10、100、1000 nmol/L;(4)AngⅡ +losartan(AT1受体拮抗剂)组:losartan 10－6mol/L预处理30 min后，再加入AngⅡ 100 nmol/L;(5)AngⅡ+PD123319(AT2受体拮抗剂)组:先用PD12331910－5mol/L预处理30 min后，再用终浓度为100 nmol/L AngⅡ;(6)CGP42112A(AT2受体激动剂)组:加入10－7mol/L CGP42112A。

4 实时定量PCR检测(P)RR mRNA表达

收集培养的细胞，应用RNA提取试剂盒提取RNA，并用紫外分光光度计进行检测，其后取5 μL RNA按照反转录试剂盒制备cDNA后，以GAPDH作为内参照，采用SYBR Green法实时定量PCR检测，反应为20 μL体系，包含上、下游引物、DNA模板、SYBR Premix Ex TaqTMII和dH2O。大鼠(P)RR上游引物5'－CATAAGCATCTCGCCAAGG －3'，下游引物5'－ACCAGGGATGTGTCGAATGA －3'，产物片段224 bp。GAPDH上游引物 5'－TGAACG GGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－ TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，产物片段307 bp。定量反应条件:95℃10 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，进行40个循环。各组PCR均重复3次。mRNA的相对表达量用 2－ΔΔCt方法来表示，其中 ΔCt=Ct目标mRNA－CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt处理－ ΔCt对照。

5 Western blotting检测(P)RR蛋白的表达

收集培养的细胞，PBS洗涤2遍，收集细胞，加入1 mL细胞裂解缓冲液，4℃旋转裂解30 min，12000 r/min离心15 min，收集上清。Bradford法测定蛋白质浓度，取60 μg的总蛋白经10%SDSPAGE胶电泳分离，常规方法转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBS－T溶液37℃封闭3 h后，加入(P)RR单克隆抗体(1∶1000稀释)4℃孵育过夜，用1×TBS溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室温(1∶10000稀释)4 h，1 ×TBS溶液洗膜 4 ×10 min。辣根过氧化物酶HRP－ECL发光法检测，用凝胶成像系统拍照，用Lab－Work软件进行灰度分析。各组实验均重复3次。

6 统计学处理

实验数据采用SPSS 13.0 For Windows软件包进行统计，数据以均数±标准差()表示，各组均数进行单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

结 果

1 大鼠血管平滑肌细胞形态观察

A7r5细胞株传代后2－3 d细胞生长达亚融合状态，显微镜下可见细胞呈梭形或长梭形，成束的细胞平行排列，表现出“峰－谷”状生长，见图1。

2 AngⅡ对VSMCs(P)RR mRNA表达的影响

与对照组比，不同浓度AngⅡ可以促进VSMCs(P)RR mRNA表达，并且呈浓度依赖性(均 P＜0.05);加入CGP42112A可以促进VSMCs(P)RR mRNA表达(P＜0.05)，加入PD123319可抑制(P)RR的VSMCs mRNA表达(P＜0.05)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR mRNA表达(P＞0.05)，见图2。

3 Ang－(1－7)对VSMCs(P)RR mRNA表达的影响

与对照组比，不同浓度 Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表达(均P＜0.05)，各浓度之间比较无显著差异(均P＞0.05)，见图3。

Figure 1.The morphological observation of rat VSMCs.The cells showed a“hill and valley”growth pattern.A:×100;B:×200.图1 大鼠血管平滑肌细胞

Figure 2.Effect of AngⅡon the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AngⅡ group.图2 AngⅡ处理各组细胞(P)RR mRNA的表达

Figure 3.Effects of Ang－(1－7)on the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.图3 Ang－(1－7)处理各组细胞(P)RR mRNA的表达

4 AngⅡ对VSMCs(P)RR蛋白表达的调节

与对照组比，不同浓度AngⅡ可以促进VSMCs(P)RR蛋白的表达，并且呈浓度依赖性(P＜0.01);加入CGP42112A可以促进VSMCs(P)RR蛋白的表达(P＜0.01)，加入 PD123319可抑制 VSMCs(P)RR蛋白的表达(P＜0.01)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR蛋白的表达(P＞0.05)，见图4。

5 Ang－(1－7)对VSMCs(P)RR蛋白表达的调节

与对照组比，不同浓度 Ang－(1－7)可抑制VSMCs(P)RR蛋白的表达(均P＜0.01)，各浓度之间比较无显著差异(均P＞0.05)，见图5。

Figure 4.Effect of AngⅡon the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup.图4 AngⅡ处理各组细胞(P)RR受体蛋白的表达

Figure 5.Effect of Ang－(1－7)on the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.图5 Ang－(1－7)处理各组细胞(P)RR受体的免疫印记结果

讨 论

RAS是机体维持正常血压、水电解质平衡的重要系统。近年来，(P)RR在心血管疾病中的作用越来越受到人们的关注。研究表明，肾素和肾素前体通过与(P)RR结合，可发挥不依赖于Ang II的生物学作用，使肾系膜细胞增殖［7］，平滑肌细胞增殖和迁移等［6］。

VSMCs异常增殖是动脉粥样硬化斑块形成、高血压和血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病共同的细胞病理学基础。在心血管系统中，VSMCs不仅是Ang II的一个重要来源，而且，也是Ang II调节血管功能的主要靶细胞。在生理或病理条件下，Ang II除直接作用于VSMCs，引发细胞收缩或增殖外，还可通过诱导VSMCs表达、释放多种生物活性物质，产生一系列继发效应。本研究发现，与对照组比，AngⅡ可以促进VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表达，并且呈浓度依赖性(均P＜0.05);加入AT2受体激动剂CGP42112A可以促进VSMCs(P)RR的mRNA和蛋白的表达，加入AT2受体拮抗剂PD123319可抑制(P)RR的 VSMCs mRNA和蛋白的表达(均 P＜0.01)，加入 AT1受体拮抗剂 losartan则不能抑制VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表达，故AngⅡ可能通过AT2受体上调(P)RR，从而促进平滑肌细胞增殖。

Ang－(1－7)是近年来发现的RAS又一新成员，主要由血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)分解 Ang Ⅱ所产生［7］。Ang －(1－7)在多种病理生理过程中拮抗AngⅡ，对于RAS过度激活所导致的病变，如高血压、心力衰竭和动脉粥样硬化等［8－10］起保护作用。亦有研究发现，Ang－(1－7)可抑制内膜损伤模型的中膜平滑肌细胞的增殖［11，12］，但其抑制 VSMCs增殖和迁移活性的分子机制至今未明。肾素和肾素前体通过与(P)RR结合，可促进平滑肌细胞迁移。本文通过用不同浓度的Ang－(1－7)干预血管平滑肌细胞，发现Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表达，各浓度之间比较无显著差异，故Ang－(1－7)抑制平滑肌细胞增殖的作用可能部分是通过调节(P)RR实现的。

肾素(原)受体系统可产生不依赖于Ang II的生物学作用，使人们更加深入地认识RAS，将会为心、血管及肾脏疾病治疗提供新的思路。

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