小鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染树突状细胞的功能变化

朱松雷，丁凤鸣，沈 策

上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，上海 200233

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是慢性呼吸道感染主要致病菌之一。它广泛分布于自然界并在人体皮肤上定植，是引起肺囊性纤维化 （CF）及弥漫性泛支气管炎（DPB）等慢性感染的最重要的病原菌，也是近年来院内感染的重要条件致病菌和耐药菌之一。树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前所知功能最强的且唯一能激活初始性T细胞的抗原提呈细胞。本研究通过建立铜绿假单胞菌慢性肺部感染动物模型，观察小鼠肺部的病理学特点及肺脏DCs的变化及分泌细胞因子的应答能力，探讨肺脏DCs在慢性感染中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健康雌性Balb/c小鼠54只，体重18～21 g，7～8周龄，由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供。铜绿假单胞菌菌株ATCC27853，购于中国微生物中心。小鼠白介素23试剂盒购于R&D公司。CD11c一抗、CD11c SABC免疫组化试剂盒 （武汉博士德），显微病理成像系统（OLYMBUS BX41），CO2孵箱，烤箱，酶标仪，比浊仪。

1.2 动物分组及模型制备

将54只小鼠分为两组，PA组30只，经气管接种铜绿假单胞菌琼脂糖珠悬液；对照组24只，经气管接种无菌琼脂糖珠悬液。铜绿假单胞菌琼脂糖珠的制备，参照于柏峰等[1]的方法并稍作改良制备。接种微量PA琼脂糖珠悬液于去纤维羊血培养皿中培养，用比浊仪调整菌落计数至5×109cfu/ml。用氯胺酮麻醉小鼠，将PA组小鼠固定在专用手术台上，颈部前侧用眼科剪剪一0.5 cm的竖切口，用眼科镊剥离挑出气管，用1 ml注射器注入40 μl铜绿假单胞菌琼脂糖珠悬液。立即竖起小鼠轻轻摇晃，保持1 min，使菌液流下进入肺内，小鼠有类似呛咳反应。切开伤口不做处理，自然愈合。对照组给予同样方法注入无菌琼脂珠悬液。

1.3 标本的采集及观察项目

观察试验后两组小鼠的一般状况，分别于接种后l、3、7、14 d用氯胺酮麻醉小鼠，经腹主动脉放血，用1 ml注射器进行肺泡灌注，分3次，分别灌注0.8、0.5、0.5 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS），收集支气管肺泡灌洗液（BALF），总回收液要＞1 ml。BALF中IL-23的测定方法严格按照说明书要求操作。检测结果通过尿素稀释倍数校正2。取游离新鲜的右肺做肺组织匀浆细菌培养。左肺肺脏立即用石蜡包埋，恒冷切片机切成厚度5 μm切片，粘于APES胶片上，一部分用HE染色观察肺大体病理改变。另一部分行免疫组化，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡，微波炉抗原修复，加血清阻断剂室温20 min，加一抗兔抗小鼠 CD11c（1∶50 稀释），37℃ 1 h，PBS 浸洗。 加入生物素标记的二抗，室温下孵育20 min，PBS浸洗。二氨基联苯胺（DAB）显色 5～10 min。常规苏木素核复染，脱水，透明及封片，光镜观察小鼠肺组织CD11c阳性表达。以胞浆和胞膜染色呈棕黄色或黄色细胞为DCs阳性细胞，免疫组化标记的每张切片随机选取10个高倍视野（400倍），计数所有染色阳性的细胞和细胞总数，细胞阳性率=阳性细胞数/细胞总数×1000‰。

1.4 统计学方法

采用SAS 8.0统计软件，实验结果计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用两样本t检验及F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

PA组小鼠毛发紊乱，表情呆滞，活力明显下降，进食和饮水减少，3～4 d表现最明显，5～7 d后状况稍有改善，有2只小鼠分别在第3天和第4天死亡。对照组小鼠一般状况明显轻于PA组，2 d左右即可恢复正常活动和饮食，无一只死亡。

2.2 小鼠的病理形态学改变

光镜下PA组感染早期肺细支气管狭窄变形，中性粒细胞浸润明显，局部出血，局灶性肺泡炎，见图1。后期纤维增生明显，可见肉芽肿形成，部分小鼠肺泡萎陷不张，出现小脓肿，淋巴细胞聚集表现，见图2。对照组早期肺泡腔稍有渗出，3 d后基本恢复正常，见图3。免疫组化发现PA组DCs在小鼠肺内分布广泛，气管、支气管、肺泡、脏层胸膜和气管周围相关淋巴组织及血管周围均可见，但以气管旁聚集明显，见图4。

图1 PA组第3天肺组织病理改变，HE染色×100

图2 PA组第14天肺组织病理改变，HE染色×100

图3 对照组第3天肺组织病理改变，HE染色×100

2.3 两组BALF中IL-23测定结果

PA组BALF中IL-23的水平早期升高明显，第3天达到峰值，7 d后仍维持在较高的水平。对照组第1天就达到峰值，随后下降，7 d后维持在稳定水平。PA组第1、3、7、14天IL-23水平均高于对照组（P<0.05）。见表1。

2.4 小鼠肺组织CD11c免疫组化结果

PA组CD11c阳性率第3天达到峰值，7 d后仍维持在较高的水平。对照组第1天就达到峰值，随后下降，7 d后维持在一定水平。PA组第1、3、7、14天CD11c阳性率均高于对照组（P<0.05）。 见表2。

3 讨论

图4 PA组肺组织免疫组化，SABC法×200

在研究PA慢性感染中，模型的建立是重要的一方面。本实验用琼脂糖包埋细菌做成琼脂珠，用富含致病菌的琼脂珠灌注小鼠气管。根据相关研究，该模型能够客观地反应铜绿假单胞菌慢性感染特性，适合用来研究肺部慢性感染及纤维疾病的特征[3]。接种后于第1、3、7、14天分别对两组小鼠分离肺组织，PA组除第7天有一只未培养出PA菌落，其余都能培养出PA菌落。而对照组未培养出PA菌落。PA组肺组织制备匀浆后，以每克肺组织所含菌落数来表示肺组织匀浆计数。PA组第7、14天的细菌培养计数均超过103cfu/g，证明此次慢性感染的动物模型是成功的。

DCs作为抗原提呈细胞（APC），是适应性免疫应答的启动者之一。同时，DCs还能够诱导免疫耐受，调节T细胞介导的免疫应答类型，在固有免疫应答中作为效应细胞抵抗微生物感染。作为引起慢性感染的代表菌PA，与DCs的关系非常复杂。有研究显示小鼠的DCs有能力对PA外膜孔蛋白F进行脉冲式的纯化或重组以保护小鼠免受PA感染[4]。在研究烧伤小鼠中，与表皮全层烧伤的小鼠比较，受表皮部分层烧伤影响的DCs因释放可溶性细胞因CCL3和 IL-12而能够在PA感染中起预防作用[5]。因为CD11c是分子量150 kD的αX亚单位β2整合素家族成员，是目前被广泛应用的树突状细胞的特异性标志物，文献报道小鼠髓系和淋巴系DCs，包括DCs前体、未成熟及活化成熟的DCs均有较高的表达率[6]。笔者用CD11c作为小鼠的DCs标志物，能够比较好的评估小鼠肺脏DCs的变化。本实验免疫组化发现PA组DCs在小鼠肺内分布广泛，气管、支气管、肺泡、脏层胸膜和气管周围相关淋巴组织及血管周围均可见，但以气管旁聚集明显。PA组免疫组化DCs阳性率明显高于对照组。因为IL-23主要表达于DCs和巨噬细胞中，而相关的研究认为像免疫调节因子IL-23的表达尤其可以作为DCs的重要特征之一[7]。本实验两组小鼠BALF中IL-23水平的变化趋势基本上与CD11c阳性率的表达一致，因此可以认为IL-23在一定程度上可以反应DCs的功能变化。通过实验可以发现PA组BALF中IL-23的表达明显高于对照组。笔者考虑在感染早期IL-23的作用可能是积极的，在早期IL-23可通过直接诱导产生IL-17，从而对病原体启动免疫反应，开启IL-23-IL-l7通路实现免疫调节。有资料显示，在动物实验中若缺乏IL-23-IL-17迅速介导的免疫反应则容易引起化脓性疾病[8]。在感染后期，PA组IL-23的水平虽较峰值下降，但比较对照组仍维持在较高的水平。IL-23的持续分泌能促进淋巴细胞的增生，可能是肉芽组织的形成及慢性细菌性感染免疫反应的一个重要因素[9]。因而笔者认为IL-23在抗微生物反应的长久保持中可能起消极地作用。在临床上，对于CF、DPB等PA慢性感染的治疗，IL-23可能是中和或阻止炎症反应的一个有效靶标。

表1 两组第 1、3、7、14天BALF 中 IL-23测定结果比较（±s，ng/L）

表1 两组第 1、3、7、14天BALF 中 IL-23测定结果比较（±s，ng/L）

注：与对照组相比，*P<0.05

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表2 第1、3、7、14天小鼠肺组织CD11c免疫组化结果比较（±s，‰）

表2 第1、3、7、14天小鼠肺组织CD11c免疫组化结果比较（±s，‰）

注：与对照组相比，*P<0.05

PA组对照组分组 第1天718.07±2.72*（n=7）13.52±3.51 （n=6）第3天21.68±5.36*（n=7）8.91±2.38（n=6）第7天16.65±2.18*（n=7）6.88±1.35（n=6）第14天15.42±2.06*（n=7）7.24±1.90（n=6）

综上所述，在小鼠的PA慢性感染中，DCs对宿主起了重要的免疫调节作用，与其持续分泌的IL-23有很大的关系。通过相关途径来降低IL-23的浓度可能为临床上治疗PA慢性感染提供了一个方向，有关的机制仍需要进一步研究探索。

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