白血病源树突状细胞表达DC-CK1的初步研究

李亮亮 柴 晔 张连生 吴重阳 曾鹏云 李莉娟 易良才 (兰州大学第二医院血液科,兰州730030)

白血病源树突状细胞(DC)与正常DC相比,其形态及免疫表型相似,但抗原提呈功能较弱,在大多数患者体内并不能产生预想的有效的抗白血病细胞毒作用[1]。如何提高DC表面共刺激分子的表达及增强DC的抗原提呈功能成为近来大多数研究的焦点,然而,并不只有共刺激分子参与免疫应答的介导,免疫反应的触发还有赖于趋化因子,尤其是树突状细胞趋化因子1(DC-CK1),对启动初始免疫应答发挥关键作用。DC-CK1是主要由DC和单核/巨噬细胞表达的一种趋化因子,与 RANTES、MIP-1α和IL-8等多种趋化因子不同,其主要选择性趋化初始T细胞(CD45RA+),而记忆T细胞(CD45RO+)不能被DC-CK1吸引,DC-CK1对初始B细胞(CD38-)亦具有趋化性,故其是免疫反应的始动者[2]。现有研究还发现,DC-CK1在抗肿瘤及疫苗佐剂等方面具有重要作用,因此检测白血病源DC表达的DC-CK1的水平对于研究白血病源DC的抗肿瘤效应和治疗都具有重要意义。关于体外诱导的白血病源DC尤其是多种白血病源DC表达DC-CK1的研究目前尚无报道,本实验将对白血病源DC分泌的DC-CK1进行初步的研究,为今后探索其在白血病源DC介导的免疫应答中的调节作用创造有利条件,并为优化白血病的免疫治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择兰州大学第二医院血液科初诊未治的25例白血病患者,年龄10～48岁,中位年龄29岁,入选病例的诊断和分期均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》。AML患者10例,其中M2 4例,M3 2例,M4 3例,M5 1例;ALL患者 7例;外周血原始细胞百分数38%～96%。CML患者8例,血常规白细胞为(57～540)×109L-1,染色体核型检查Ph阳性率为 100%。健康志愿者 10例,年龄20～46岁,中位年龄31岁。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基:美国Gibco公司产品,配制按说明书,4℃保存。胎牛血清:杭州四季青生物制品公司产品,56℃30分钟灭活后分装,-20℃冻存备用。rhGM-CSF及rhIL-4为厦门特宝生物工程公司提供,TNF-α购自 PeproTech公司。CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR 单抗均购自美国Caltag公司。RT-PCR试剂盒购自Roche公司。人巨噬细胞炎症蛋白4(MIP-4)试剂盒购自美国R&D公司。

1.3 DC的诱导培养 参考文献[3],稍做修改。用无菌肝素抗凝管采集白血病患者及正常人外周血10 ml,PBS液等量稀释,经淋巴细胞分离液密度梯度离心,获取单个核细胞(PBMC),用PBS缓冲液洗涤2次,弃去上清,用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI1640完全培养基调整细胞浓度为2×106ml-1,接种于24孔培养板中,每孔1 ml,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养6小时,弃去悬浮细胞,在贴壁细胞中加入培养液,并加入rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 100 ng/ml,吹打混匀后继续培养。隔日半量换液并添加首次剂量1/2的细胞因子,在倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化。培养第6天,加入TNF-α100 ng/ml,第8天收获细胞。

1.4 形态学观察 细胞在加入细胞因子后形态发生了明显的变化,在倒置显微镜下逐日观察,并收集第3及8天的细胞悬液,离心后涂片、自然干燥,进行Wright染色镜检。

1.5 免疫表型检测 流式细胞仪检测DC的表面标志,培养8天后的细胞用PBS液调整细胞浓度为1×106ml-1～5×106ml-1,取细胞悬液100 μl/管,分别加入鼠抗人HLA-DR、CD80、CD86、CD83 及 CD1a单抗,混匀后4℃避光孵育30分钟,再用PBS液离心洗涤2次,以1%多聚甲醛固定细胞20分钟后上机检测,分析软件为CellQuest。

1.6 DC-CK1mRNA的RT-PCR分析 Trizol法从培养8天的细胞中提取总RNA,逆转录获取cDNA后进行PCR扩增。DC-CK1mRNA 引物上游:5′CCTCTGCTCCTGTGCACAAGT-3′,下游 :5′TGCAGCTCAACAATAGAAATCAATT-3′,扩增片段为424 bp;内参照GAPDH引物上游:5′GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′,下 游:5′GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,扩增片段为214bp,反应体系50μl,扩增条件:94℃变性30秒,60℃退火40秒,72℃延伸1分钟,34个循环,最后72℃延伸10分钟。各取5μl扩增产物,以2%琼脂糖凝胶电泳。半定量分析通过成像系统软件Quantity One,计算DCCK1mRNA的吸光度值与内参照A值的比值。

1.7 细胞培养上清液中DC-CK1浓度的ELISA测定

采用双抗体夹心ELISA法检测DC培养上清液中DC-CK1的含量,具体操作步骤按试剂盒说明书进行,显色后通过WALLAC VICTOR-1420多功能时间分辨免疫分析系统检测。

2 结果

2.1 DC的形态观察 新分离的外周血单个核细胞呈圆形,大小均等,分散分布,加入GM-CSF及IL-4后细胞形态出现改变。培养第3天,细胞数量增多,聚集生长,形成多个小细胞团,细胞形态不规则,少数细胞周围出现细小的毛刺,部分细胞悬浮;培养第6天,不规则形细胞增多,细胞团的直径增大,细胞边缘的突起变长,悬浮细胞增多;培养第8天(加入TNF-α 2天),大部分细胞呈悬浮状,细胞周围可见大量较长而粗的树枝样棘突,呈现典型的DC形态,各组DC的形态变化相似,以下是AML-DC的形态图(图1)。

2.2 DC免疫表型结果 白血病源DC与正常人DC表达的 DC 免疫标记 CD80、CD86、CD83、CD1a及HLA-DR以流式细胞仪检测没有明显差别,其阳性细胞比例见表1。

2.3 DC-CK1mRNA的RT-PCR检测结果 采用RTPCR技术从核酸水平检测DC-CK1的表达水平,AML-DC、CML-DC和ALL-DC中 DC-CK1mRNA的表达水平分别为0.26±0.025、0.27±0.020和0.29±0.034,均明显低于正常DC(0.43±0.032),差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

表1 白血病源DC和正常DC的免疫表型分析(±s,%)Tab.1 Immunophenotype of leukemia-DC and normal DC(±s,%)

表1 白血病源DC和正常DC的免疫表型分析(±s,%)Tab.1 Immunophenotype of leukemia-DC and normal DC(±s,%)

Groups n CD80 CD83 CD86 CD1a HLA-DR Normal-DC 10 74.76±11.23 82.08±11.73 78.14±11.54 73.05±13.57 81.55±10.40 AML-DC 10 72.20±10.63 81.49±11.05 77.01±8.96 70.32±13.14 78.15±10.41 CML-DC 8 71.44±11.30 79.46±13.41 76.56±10.03 68.78±12.29 77.39±10.31 ALL-DC 7 69.66±10.09 76.98±11.73 73.43±11.49 66.75±10.88 73.06±11.48 F 0.325 0.301 0.288 0.373 0.888 P 0.807 0.825 0.833 0.773 0.458

图1 AML-DC的形态变化图(瑞氏-染色,×1 000)Fig.1 Morphology changes of AML-DC(Wright-staining,×1 000)

图2 RT-PCR检测白血病源DC与正常DC的DCCK1mRNA表达水平Fig.2 Expression of DC-CK1mRNA in leukemia-DCand normal DC detected by RT-PCR

2.4 DC-CK1的ELISA检测结果 应用ELISA法检测培养上清中DC-CK1的水平,结果发现白血病源DC表达的DC-CK1的水平同样比正常DC明显降低,AML-DC组:(152.32±34.74)pg/ml(n=10);CML-DC组:(163.06±40.97)pg/ml(n=8);ALL-DC组:(173.80±40.44)pg/ml(n=7);正常-DC组:(320.55±39.93)pg/ml(n=10),白血病各组之间无显著性差异(P＜0.05),但各白血病组与正常对照组之间差异有统计学意义(P＞0.05)。见图3。

图3 ELISA检测白血病源DC与正常DC上清中DC-CK1的分泌水平Fig.3 Secretion level of DC-CK1 in supernatants of leukemia-DC and normal DC detected by ELISA

3 讨论

DC-CK1是1997年由Adema等人[4]首次在DC文库发现其cDNA,故命名之,也可称肺部活化调节趋化因子(PARC)、选择性巨噬细胞活化相关的CC组趋化因子-1(AMAC-1)、巨噬细胞炎症蛋白4(MIP-4)及趋化因子配体18(CCL-18),其受体和鼠的同系物到目前为止还不太清楚,故对DC-CK1的研究相对较少。DC-CK1除了具有诱导初始免疫反应的独特生物学特性外,尚具有抗肿瘤及疫苗佐剂的特性。Akiko等人[5]将人DC-CK1基因转导至中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO),发现与仅接受细菌载体的CHO细胞比较,转基因CHO细胞的增殖明显被抑制,证实了DC-CK1通过趋化并激活初始T细胞具有抑制肿瘤生长的作用。另外Bruna-Romero等人报道[6],DCCK1在小鼠体内与疟疾疫苗共同作用时能够增强CD8+T细胞免疫反应,而由DC激活的CD8+T细胞对于阻止白血病的复发至关重要[7]。因此,了解体外诱导的白血病源DC表达的DC-CK1水平对于设计有效的抗白血病DC疫苗具有非常深远的意义。

DC成熟对DC-CK1产生的影响在多数研究中仍存在一些争论,有些研究提出随着DC的成熟,DC-CK1的分泌逐渐下调,而另一些研究则认为DC成熟增加DC-CK1mRNA的表达水平[2]。基于上述研究,本实验通过诱导白血病源DC产生,了解DCCK1的mRNA与蛋白质水平的变化趋势是否一致,以明确成熟的白血病源DC表达的DC-CK1的水平是升高还是降低。我们通过细胞形态及免疫表型证实,AML、ALL及CML三种细胞在体外均能够诱导成DC,且各型白血病源DC的形态变化及表面标志与正常DC相似,这与多数研究结果一致[3,8,9]。需要提出的一点是,由于白血病细胞具有特异的异常核型及表面异常表达某些分子,在培养后仍有保留,故与正常DC相比,白血病源DC通常表达而正常DC不表达的特异表面分子或异常核型,这是二者的不同之处。在此基础上,运用RT-PCR技术对白血病源DC的DC-CK1mRNA表达水平进行检测,结果显示成熟的白血病源DC其DC-CK1mRNA的表达量降低。采用ELISA法测定培养上清中DC-CK1的含量,结果表明DC-CK1的分泌受到限制,含量明显下降,这说明DC-CK1mRNA表达水平的降低与趋化因子蛋白分泌的抑制是一致的,研究结果与Vulcano等人[10]的报道基本相符,他们运用Northern blot和ELISA法对DC-CK1的表达水平进行了分析,显示mRNA水平与蛋白质水平的变化趋势一致,均为降低。研究结果显示无论从核酸水平还是蛋白质水平来看,白血病源DCs表达的DC-CK1的水平明显低于正常DC,差异有统计学意义(P＜0.05),这就提示白血病微环境中的某些因素可能抑制了DC-CK1的分泌。

Motta等人[11]的最新报道表明,在DC的体外分化过程中白血病细胞产物能够刺激单核细胞产生内源性的TNF-α及 IL-1β等细胞因子。TNF-α及IL-1β是由单核细胞产生的典型的炎性细胞因子[12],当单核细胞分化为DC时,二者的水平均降低,但当白血病细胞如K562上清存在时二者的表达水平明显增加。而有研究表明TNF-α与 IL-1β及其他因子如LPS、CD40L或RANKL等均能够促进DC的成熟,但其均抑制DC-CK1的产生[10,13]。故考虑虽然产生的白血病源DC可能是成熟的,但其DC-CK1的分泌将在内源性抑制因子的作用下受到限制,因此推测白血病源DC表达的DC-CK1的水平比正常DC低,我们的研究结果与这一推测相符。由于本实验对内源性TNF-α及IL-1β的水平没有进行检测,关于二者对DC-CK1的影响尚不确定,故需要进一步研究来证实。DC-CK1的抑制意味着白血病源DC对初始T细胞的趋化性减弱,刺激T细胞的能力降低,最终可能导致白血病源DC的抗原提呈能力比正常DC弱。这就为我们从特殊的趋化因子这条途径研究白血病源DC的抗肿瘤能力提供了新的依据。

总之,DC-CK1是一类特殊的趋化因子,能够诱导初始免疫反应,在DC介导的抗肿瘤免疫反应中占有重要的地位,其抑制可能有助于肿瘤的存活。因此,本实验通过对白血病源DC表达的DC-CK1进行研究,为今后通过各种方法利用DC-CK1来增强DC的抗白血病效应提供了可靠的理论基础,对发展及改善白血病的免疫治疗具有重要的临床价值。

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