鹰嘴豆芽素A通过PPARα/γ抑制脂多糖诱导猪外周血单个核细胞炎性细胞因子的分泌①

邱龙新 林一平 林臻桢 林丽钦 戴爱玲 杨小燕 (龙岩学院生命科学学院,龙岩364000)

植物异黄酮是一类与人类生活息息相关的植物雌激素,长期以来其雌激素样作用、抗肿瘤作用、心血管保护作用和抗氧化作用受到广泛重视和深入研究。最近,植物异黄酮在抗炎症方面的作用引起了越来越多的关注[1]。红车轴草异黄酮提取物能够显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α、IL-6等炎性细胞因子,说明该异黄酮提取物具有抗炎症的作用[2]。大豆异黄酮、鹰嘴豆异黄酮提取物等植物异黄酮也都具有类似的抗炎作用。大豆异黄酮主要含有染料木黄酮、大豆素等异黄酮成分,而红车轴草异黄酮主要含有鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黄酮、大豆素等4种异黄酮成分。目前,大豆异黄酮的抗炎作用被认为主要是染料木黄酮的作用。染料木黄酮的抗炎作用和机制已经得到较为深入的研究[1],但是,对于鹰嘴豆芽素A的抗炎作用却少有报道,对于其机制的研究更是尚未见报道。

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是配体激活的转录因子核受体超家族成员之一,目前已知有三种亚型:PPARα、β/δ和γ。PPARs在免疫细胞上广泛表达,近年来的研究发现,PPARs在抵抗炎性疾病和免疫调节方面具有重要作用[3]。有趣的是,鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黄酮等具有PPARα/γ双激动剂活性,一些研究据此推测这些异黄酮的抗炎作用与其PPARα/γ双激动剂活性有关[2,4]。但是,目前并没有直接的证据证明鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黄酮等通过PPARα/γ途径调控炎症反应。另外,在单核细胞和淋巴细胞中PPARα与PPARγ均有较多表达而在巨噬细胞中PPARα几乎不表达[5,6]。为了研究鹰嘴豆芽素A对免疫细胞分泌炎性细胞因子的影响及其与PPARα/γ的关系,以外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)为研究材料将较为合适。综上,本研究将因此利用PBMCs探讨鹰嘴豆芽素A的抗炎作用及其是否通过PPARα/γ途径调控炎症反应。

1 材料与方法

1.1 材料 猪血采自福建龙岩龙马种猪场;Ficollpague淋巴细胞分离液购自GE Healthcare公司;RPMI1640细胞培养基、Trizol购自Invitrogen公司;LPS、鹰嘴豆芽素 A、GW9662、MK886、羊抗兔 IgG-HRP 等购自 Sigma公司;NF-κB p65抗体购自 Cell Signaling公司;PCRmix购自广州东盛生物科技有限公司;细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所;其它试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 猪PBMCs的分离与药物处理 采集猪血自150日龄杜×长×大母猪,利用Ficoll-paque淋巴细胞分离液(密度1.077 g/ml)按厂家说明分离猪PBMCs。细胞悬浮于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素)并以1×107个/ml的密度将细胞接入24孔板,在 5%CO2,37℃条件下培养。加入待研究药物孵育3小时,然后加入LPS(终浓度1μg/ml)进行刺激。

1.2.2 PBMCs分泌 TNF-α、IL-6的测定 LPS处理细胞6小时后收集细胞培养液,2 000 r/min离心15分钟后收集上清液,利用ELISA试剂盒(R&D systems)按厂家说明测定上清液中TNF-α、IL-6的含量。

1.2.3 RT-PCR分析TNF-α、IL-6 mRNA 的表达LPS处理细胞6小时后,用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒(Fermentas)按厂家说明将RNA反转录成cDNA,PCR 扩增 TNF-α、IL-6,以 β-Actin作为内参。引物序列如下,Sense:5′-CGTTGTAGCCAATGTCAAAGCC-3′,Antisense:5′-TGCCCAGATTCAGCAAAGTCCA-3′(TNF-α);Sense:5′-CCAGGAACCCAGCTATGAAC-3′,Antisense:5′-CTGCAGAGCCTCGACATT-3′(IL-6);Sense:5′-CTGGCATTATCATAAACTCT-3′,Antisense:5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′(β-Actin)。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后用溴化乙锭显色。

1.2.4 NF-κB活性的分析 NF-κB的激活可以通过它从胞浆移位至胞核来判定。LPS处理细胞30分钟后,用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒按厂家说明进行操作分别获得胞浆与胞核蛋白。用Western blot技术检测NF-κB的进核情况。一抗(NF-κB p65)以1∶1 000浓度4℃孵育过夜,二抗(羊抗兔)以1∶2 000浓度孵育2小时后显影。

1.3 数据处理与统计学分析 实验数据采用GraphPad Prism 5.0软件处理。组间用One-Way ANOVA with Newman-Keuls Multiple Comparison Test比较。当P值＜0.05时差异被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 鹰嘴豆芽素A对LPS刺激猪PBMCs后TNF-α、IL-6分泌量和mRNA表达的影响 TNF-α是一种与炎症反应密切相关的促炎症细胞因子。ELISA结果显示,猪PBMCs在经LPS刺激后,TNF-α的分泌较未经LPS刺激时大幅上调(P＜0.001,图1A)。而在加入LPS刺激前3小时用鹰嘴豆芽素A预处理细胞则能显著抑制由LPS刺激引起的TNF-α的分泌,终浓度为100μmol/L的鹰嘴豆芽素A(P＜0.001)比50 μmol/L的(P＜0.01)抑制作用效果更明显。利用RT-PCR分析mRNA表达的结果进一步证明了鹰嘴豆芽素A抑制TNF-α生成的作用(图1B)。

IL-6为另一种促炎症细胞因子。如图2A所示,猪PBMCs在经LPS刺激后,IL-6的分泌较未经LPS刺激时大幅上调(P＜0.001)。同样的,在加入LPS刺激前3小时用鹰嘴豆芽素A预处理细胞则能显著抑制由LPS刺激引起的IL-6分泌量的增加,终浓度为100μmol/L的鹰嘴豆芽素A(P＜0.001)比50 μmol/L的(P＜0.01)抑制作用效果更明显。对IL-6 mRNA表达的研究进一步证实了上述鹰嘴豆芽素A抑制IL-6生成的结果(图2B)。这些以TNF-α和 IL-6为代表的结果表明鹰嘴豆芽素A能显著地抑制PBMCs分泌炎性细胞因子。

图1 鹰嘴豆芽素A对LPS刺激猪PBMCs后TNF-α分泌(A)和mRNA表达(B)的影响Fig.1 Effect of biochanin A on the secretion(A)and mRNA expression(B)of TNF-αin porcine PBMCs

图2 鹰嘴豆芽素A对LPS刺激猪 PBMCs后IL-6分泌(A)和mRNA表达(B)的影响Fig.2 Effect of biochanin A on the secretion(A)and mRNA expression(B)of IL-6 in porcine PBMCs

2.2 鹰嘴豆芽素A对LPS刺激猪PBMCs后NF-κB激活的影响 NF-κB的激活对LPS诱导炎症因子的释放具有重要作用。NF-κB在正常情况下以无活性的三聚体形式存在于胞浆中,受刺激活化进入细胞核引起下游多种基因表达,NF-κB通路是LPS诱导炎症因子表达的关键信号通路。可以通过Western blot技术分析NF-κB蛋白在细胞质与细胞核之间的转移来检测NF-κB的激活。如图3所示,在正常情况下猪PBMCs细胞核内仅有少量的NF-κB,在经30分钟LPS处理后胞浆内NF-κB蛋白含量下降,核内NF-κB含量显著增加,说明 LPS处理后NF-κB被激活。而在LPS刺激前用鹰嘴豆芽素A预处理3小时,可抑制NF-κB的进核,说明鹰嘴豆芽素A可以抑制LPS诱导的猪PBMCs NF-κB信号途径的活化。

2.3 鹰嘴豆芽素A通过PPARα与PPARγ途径抑制LPS刺激猪PBMCs后NF-κB的激活 LPS刺激前用终浓度为100μmol/L的鹰嘴豆芽素A和10μmol/L PPARγ拮抗剂GW9662共同预处理猪PBMCs,这时PPARγ的作用会被GW9662大幅消除。图4显示,在PPARγ无法发挥作用的情况下,鹰嘴豆芽素A对LPS诱导的猪PBMCs NF-κB信号途径活化的抑制作用被显著减弱;同样,LPS刺激前用鹰嘴豆芽素A和20μmol/L PPARα拮抗剂 MK886共同预处理猪PBMCs以抑制 PPARα途径,鹰嘴豆芽素A对LPS诱导的猪PBMCs NF-κB信号途径活化的抑制作用也被显著减弱。说明鹰嘴豆芽素A可以通过PPARα和PPARγ途径抑制 LPS诱导的猪PBMCs NF-κB信号途径的活化,鹰嘴豆芽素A对LPS刺激PBMCs后炎症因子的释放具有抑制作用的原因至少有一部分可归因于鹰嘴豆芽素A通过PPARα和PPARγ途径调控NF-κB信号途径的活化。

图3 鹰嘴豆芽素 A对LPS刺激猪PBMCs后NF-κB p65进核激活的影响Fig.3 Effect of biochanin A on the nuclear translocation of NF-κB p65

图4 PPARα或 PPARγ拮抗剂减弱了鹰嘴豆芽素A对LPS诱导猪PBMCs NF-κB p65进核激活的抑制作用Fig.4 PPARαor PPARγantagonist attenuated the suppression effect of biochanin A on the nuclear translocation of NF-κBp65 in LPS-stimulated porcine PBMCs

3 讨论

体内体外的一些研究已经证明一些异黄酮具有抗炎作用。在这些异黄酮化合物中,染料木黄酮是被最为广泛研究的一种,它的抗炎作用在小鼠、人体内和在一些细胞株内被深入探讨[1]。大豆素的抗炎症作用也有过一些报道[1]。然而,对鹰嘴豆芽素A的抗炎症作用却很少有报道。本研究报道了鹰嘴豆芽素A具有抑制猪PBMCs经LPS刺激引起TNF-α和IL-6等炎症因子分泌的作用,这与Muller等[2]在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的研究结果一起证实了鹰嘴豆芽素A的抗炎症作用。

染料木黄酮的抗炎作用机制已被深入地研究,它可以通过抗氧化和清除自由基、抑制COX-2的表达、调控MAPK的表达和调控NF-κB信号途径来抵抗炎症反应[7-12]。然而,鹰嘴豆芽素A的抗炎作用机制未见任何报道。本研究报道了鹰嘴豆芽素A可以通过抑制LPS诱导NF-κB信号途径的活化来抑制炎症反应,同时,本研究进一步发现了鹰嘴豆芽素A对NF-κB信号途径的调控是依赖于PPARα和PPARγ这两种核受体的。有趣的是,刺芒柄花素具有比鹰嘴豆芽素A更高效的PPARα/γ激动剂活性,但是其抑制RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6的能力却比鹰嘴豆芽素 A更低[2,4]。更为复杂的是,PPARγ激动剂匹格列酮具有抑制RAW264.7细胞释放TNF-α的作用而PPARγ另一种激动剂罗格列酮却没有这种作用[5,13]。本研究小组在RAW264.7细胞中进行的研究也发现虽然染料木黄酮具有PPARα/γ激动剂活性,但其对炎症因子释放的抑制并不依赖于PPARα/γ途径(数据未展示)。另外,本研究小组还发现在RAW264.7细胞中,鹰嘴豆芽素A的抗炎作用只依赖于PPARγ途径而不依赖于PPARα途径(数据未展示),这可能与在RAW264.7细胞中PPARα的表达量很低有关。总之,异黄酮的抗炎症作用与其PPARα/γ激动剂活性的关系还有待更深入的研究。

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