Rab7 GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达①

王玉珍 谢基明 王宁飞 刘 帅 (内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018)

Rab GTPases(Ras-related proteins in brain)是Ras超家族中的一类GTP酶。一些Rab蛋白在从酵母到人类的进化过程中高度保守[1]。Rab蛋白调控着囊泡的出芽、形成、转运、锚定和融合等过程[2]。Rab GTPases能够在GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式之间转换。在GTP结合的活性形式,GTPases与下游的效应分子相互作用,共同调节了囊泡转运的各个环节[3]。

Rab GTPase 7(Rab7)定位于晚期内体/溶酶体结构,调控着囊泡运输的晚期过程[4]。近年来的研究表明,Rab7通过转运受体蛋白广泛地参与了信号转导过程。Rab7参与转运血管紧张素II受体 1A(AT1AR)、EGFR、神经生长因子受体TrKA到溶酶体降解[5-7]。Rab7与Toll-like receptors(TLRs)的关系如何,报道甚少。

多聚肌苷酸poly I:C(polyinosinic-polycytidylic acid)是一种人工合成的模拟病毒RNA的双链RNA(dsRNA),诱导免疫细胞产生Ⅰ型干扰素,类似于病毒感染后效应[8]。poly I:C诱导的活化效应是通过Toll-like receptor 3(TLR3)来介导的[9]。TLRs是一类模式识别受体,通过识别病原体相关的分子模式,启动免疫应答。尽管TLRs信号的充分活化对于清除入侵的病原体必不可少,但是TLRs的过度活化可能促进免疫病理性疾病的发生[10],因此负向调节TLRs的信号转导过程成为当前研究的热点问题。

在TLRs的信号转导过程中,TLR3活化免疫细胞是通过胞内的接头蛋白TRIF促进前炎症因子以及IFN-α/β的产生[11]。负向调节TLR3的信号转导通路,从而抑制前炎症因子以及IFN-α/β的产生对于防治自身免疫性疾病具有积极的意义。

在本实验中,通过构建Rab7的失活突变载体,研究Rab7失活突变后对poly I:C激活的巨噬细胞RAW264.7中前炎症因子以及IFN-β的影响。该实验为进一步研究Rab7对TLR3信号通路的调控奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 小鼠巨噬细胞系RAW264.7来自于ATCC;胎牛血清、DMEM 培养基购自Gibco公司;poly I:C购自Sigma公司;TRIZOL、反转录试剂盒、Taq酶,real-time PCR mix均为宝生物公司产品;转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;Rab7抗体、actin抗体均为Santa Cruz公司产品。

1.2 突变载体的构建 将测序正确的野生型Rab7真核表达载体pcDNA3.1-Rab7经过PCR定点突变将Rab7蛋白序列中GKT/S结构域22位的T(苏氨酸)突变为N(天冬氨酸)。该突变载体记为pcDNA3.1-tRab7。这种突变使Rab7与GTP的结合能力下降,表现为功能显性失活[12]。突变导入引物为:sence5′-GGT GTT GGA AAG AAC TCT CTC-3′和 antisence 5′-GTT GGGGGCAGT CACATC-3′。PCR 反应条件为:94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分钟,30个循环,后续的PCR产物酶切、连接反应和细菌转化实验按试剂盒说明书进行。阳性克隆经测序鉴定。

1.3 小鼠巨噬细胞株RAW264.7的培养及细胞转染 RAW264.7细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置37℃5%CO2培养箱中培养,1～2天换液或传代一次。细胞转染时,将适量的RAW264.7巨噬细胞接种于相应的细胞培养板或培养皿中(24孔板:2×105;6孔板:4×105),37℃培养过夜。待细胞密度达到近90%时,进行转染。转染方法参照脂质体Lipofectamine 2000的说明书进行。转染后40小时,采用poly I:C(10μg/ml)进行刺激。

1.4 总RNA提取及定量分析 总RNA采用TRIZOL试剂根据说明进行提取。RT-PCR和 real-time PCR 使用的 引 物 序列 为:IFN-β:5′-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3′(sence)和 5′-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3′(antisence)。IP10:5′-TGCCGTCATTTTCTGCCT-3′(sense)和 5′-GGTCATCATTCTTTTTCATCGT-3′(antisence)。TNF-α:5′-ACT TGG TGG TTT GCT ACG-3′(sence)和5′-ACT GAA CTT CGG GGT GAT-3′(antisence)。 IL-1β:5′-TTG GGG TCC GTC AAC TTC-3′(sence)和 5′-CTA ATA GGCTCA TCTGGG-3′(antisence)。real-time PCR采用ABI 7300(Applied Biosystems,USA)and SYBR RT-PCR kit进行检测分析,计算方法采用2-ΔΔct法 。

1.5 Western blot检测 2×105RAW264.7在密度达到90%时转染1μg的 pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab7和pcDNA3.1/tRab7。转染后48小时,提取胞浆蛋白,BCA法测定蛋白浓度,等量的蛋白进行SDSPAGE。蛋白随后转移到硝酸纤维素膜,采用Rab7的一抗和相应二抗与膜孵育,ECL法检测结果。同时检测actin的表达作为上样一致的内参。

1.6 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行t检验分析,P＜0.05时认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 Rab7突变载体的构建及质粒转染RAW264.7细胞后Rab7表达 我们将测序正确的Rab7真核表达载体采用定点突变法进行Rab7突变质粒的构建。在图1A的Rab7的蛋白序列中,GDSGVGKT是GTP酶家族保守的、与GTP结合的区域,其中该结构域中的T(苏氨酸)突变为N(天冬氨酸)后,表现为与GTP结合能力下降的显性失活形式。然后我们将突变质粒 pcDNA3.1-tRab7及其对照质粒转染RAW264.7细胞,转染后48小时,检测Rab7的表达。如图1B所示,与对照组相比,野生型和突变Rab7质粒转染后Rab7的蛋白水平都显著增高,显示出过表达状态。

2.2 Rab7抑制了poly I:C诱导的IFN-β表达 我们检测了 Rab7过表达后对 poly I:C刺激的RAW264.7巨噬细胞IFN-β的产生。如图2A、B所示,Rab7过表达后显著抑制了 IFN-β的表达,Rab7突变后却促进了IFN-β的表达,说明Rab7 GTPase是以GTP结合的活性方式来发挥作用的。

2.3 Rab7抑制了poly I:C诱导的IP10的表达 我们检测了Rab7过表达后对poly I:C刺激的RAW264.7细胞趋化因子IP10的表达。Rab7也是以依赖GTP结合活性的方式抑制了IP10的表达(图3A、B)。

图1 Rab7突变示意图及Rab7的表达水平Fig.1 The diagram of Rab7 mutation and detection of Rab7 expression

图2 Rab7抑制了RAW264.7细胞中poly I:C诱导的IFN-β表达Fig.2 Rab7 inhibited the expression of IFN-βin RAW264.7 after stimulation with poly I:C

图3 Rab7抑制了RAW264.7细胞中poly I:C诱导的IP-10表达Fig.3 Rab7 inhibited the expression of IP10 in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

图4 Rab7抑制了RAW264.7细胞中poly I:C诱导的TNF-α和 IL-1βFig.4 Rab7 inhibited the expression of TNF-α和 IL-1β in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

2.4 Rab7抑制了前炎症因子TNF-α和IL-1β的表达 前面的研究结果显示,Rab7能够通过结合GTP的活性形式抑制poly I:C诱导的IFN-β和IP10的表达。这两个细胞因子是受转录因子IRF3或IRF7调控,我们想进一步探索,Rab7是否对poly I:C活化TLR3的信号通路中转录因子NF-кB调控的前炎症因子的影响。如图 4A、B所示,Rab7同样抑制了TNF-α和 IL-1β的表达。与 IFN-β和 IP10的产生不同的是,Rab7突变后,IL-1β在poly I:C刺激24小时后表达最高。

3 讨论

Rabs蛋白家族特征是具有与GDP/GTP的结合保守的“G domain”。在Rab7的相关研究中,Rab7的突变体Rab7T22N,即第22位的苏氨酸(T)突变为天冬酰胺(N),该突变体降低了与GDP/GTP的亲和力,Rab7表现为功能丧失。Bucci Cecilia实验室的研究表明,野生型 Rab7能够与 GTP结合,而突变体Rab7T22N不能与GTP结合,因此Rab7T22N被称为显性失活体[12]。在我们的研究中,通过PCR定点突变法,也成功地将小鼠野生型Rab7(mRab7)突变为Rab7T22N(tRab7),为后面的研究打下基础。随后,我们将突变质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,Western blot的结果显示出过表达状态,说明Rab7质粒已经成功转入并在细胞内表达。

近年来,Rab7与信号转导的关系是新的研究热点。研究表明,PC12细胞中转染Rab7T22N后使神经生长因子受体TrkA聚集在内体,并促进了NGF诱导的TrkA的信号转导,比如ERK1/2的磷酸化水平增高、神经元生长和GAP-43蛋白的表达[7]。然而关于Rab7与TLRs的转运和信号转导的研究甚少。我们以前的研究结果表明,Rab7的同源分子Rab7b能够通过转运TLR4受体到溶酶体降解从而负向调控了TLR4的信号转导过程[13]。而 Rab家族的Rab10能够通过促进TLR4转运到细胞膜而促进了TLR4的信号转导[14]。我们的研究结果显示,过表达Rab7能够抑制poly I:C诱导的细胞因子的表达,该研究为Rab7与TLR3的信号转导打下基础。

TLR3通过接头分子TRIF一方面会活化转录因子NF-kB调控前炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的释放;另一方面会活化转录因子IRF3,其主要调控Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)的产生[15]。趋化因子IP10病毒感染时增高,其产生受IFN的调控。在我们的实验中检测到,Rab7过表达后不仅抑制了IP10和IFN-β的表达,也抑制了前炎症因子 TNF-α、IL-1β的产生。而 Rab7失活突变后逆转了以上效应,说明Rab7发挥作用依赖于其GTP结合活性。poly I:C是有效的病毒dsRNA的模拟剂,我们的结果提示Rab7可能与病毒逃逸机体的免疫反应有关,相关研究将会揭示病毒与免疫细胞的相互关系。

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