A－A大鼠模型足肿胀针灸方案优选对局部病理组织中ICAM－1表达的影响

李鑫元，郭荣胜，李元鑫，邹永艳，徐春梅，周振坤△

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150086;2.山东省威海市中医院，山东威海264200;3.黑龙江省中医研究院，黑龙江哈尔滨150036)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)简称类风湿，是一种慢性、系统性及炎症性疾病，主要累及四肢小关节及某些内脏。过去认为本病属胶原系统疾病，现已证明类风湿关节炎主要是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性系统性疾病，病变的主要位置是关节的滑膜，其次为浆膜，心、肺、血管、神经及眼等结缔组织也可广泛发生的免疫性疾病，病程迁延。

在前期研究中，笔者通过实验，做了A－A大鼠模型足肿胀针灸方案优选疗效的初步观察。结果证实，针灸治疗RA有肯定的临床疗效，能缓解RA的局部症状，减轻关节肿胀。

尽管RA是一种全身性的免疫性疾病，而局部病变是RA病的最主要的临床表现，其基本特征是关节滑膜炎，ICAM－1是最重要的白细胞－内皮细胞间粘附分子之一，介导白细胞与血管内皮细胞之间的粘附及白细胞穿出血管壁这一复杂过程，在炎症过程中发挥着重要的作用。既然针灸对RA临床症状的改善具有良好的效果，对A－A大鼠的足肿胀度具有明显的消肿作用，那么，针灸对于RA局部病理变化及ICAM－1的表达有何影响?在此研究基础上，笔者对针灸治疗A－A大鼠模型的疗效进行进一步观察，以A－A的病理形态学变化及局部病理组织中ICAM－1表达为指标，以优选出针灸治疗类风湿性关节炎的最佳治疗方案。

在本实验中用氟氏完全佐剂建立了大鼠关节炎模型，许多放射学研究结果一致认为，A－A模型是针对长期病理学改变研究RA的较为理想的动物模型。本研究中，仍以A－A大鼠模型为实验对象，实验方法运用正交设计的原理，选用整体取穴、局部取穴和病程为三因素，把火针、艾灸、毫针和对应病程(诱导后3天、7天、14天)列为三水平，从A－A的病理形态学变化及局部病理组织中ICAM－1表达方面对针灸治疗A－A大鼠模型的疗效进行进一步观察。

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠120只，雌性，体重145～170 g，6～8周龄，合格证号:黑动字P00102005。

1.2 主要实验试剂及仪器

氟氏完全佐剂(Freund＇s Complete Adjuvant，FCA)美国Sigma公司产品，批号:102k8930，内含0.1%灭活分支杆菌;ICAM－1免疫组化试剂合，批号:BA0541;8%多聚甲醛、EDTA、多聚－L－赖氨酸、磷酸盐缓冲液(PBS):PH 7.4、柠檬酸缓冲液:0.01M PH 6.0、抗体稀释液、DAB显色试剂合;光学显微镜(BH－2型)日本Olympus公司;毫针采用华佗牌针灸针，规格0.28 mm×15 mm;艾灸:以艾绒制麦粒大艾柱;火针:贺氏细火针。

2 实验方法

2.1 模型建立

氟氏完全佐剂诱导大鼠关节炎A－A模型的建立方法:右后足垫部皮内注入FCA 0.1 ml于每只大鼠，建成A－A大鼠模型。

2.2 实验分组

参照正交设计的方法，分析影响疗效的因素，采用病程、局部取穴和整体取穴为三因素，局部与整体有交互作用，把毫针、火针、艾灸列为三水平。选取L9(34)正交设计表，将120只实验动物模型随机分成10组，每组12只，设立1组为模型对照观察组，其余9组随机分入9组实验中，进行疗效观察。

2.3 治疗方法

取穴方法:以华兴邦等［1～2］研制的“大鼠穴位图谱”为依据，参考比较解剖和骨度分寸法，模拟定位。整体取穴为:肾俞、大椎;局部取穴为:趾间、足三里。火针每3天1次，速刺，不留针。毫针、艾灸每2天1次，毫针留针30 min，艾灸时剪去穴位上鼠毛施灸，每穴3壮。各组均常规局部消毒后进行治疗，一疗程为30天。

2.4 观察指标及制备方法

2.4.1 病理切片制备

快速颈椎脱位处死大鼠，立即除皮，切取足踝掌部，立即放入8%多聚甲醛溶液中固定，经EDTA脱钙，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，片厚约3～5 μm，分别用于HE染色观察和免疫组织化学染色。HE染色下观察炎细胞浸润，滑膜增生，血管翳形成，软骨破坏。采用免疫组织化学的方法观察关节滑膜组织ICAM－1蛋白的表达。

2.4.2 病理情况定量分析

HE染色按照病变的严重程度给予“+”、“++”、“+++”不同级别的定量。求病理系数=(炎症分值+滑膜分值+血管翳分值+软骨分值)/理论最大值。①炎症由轻到重分为4级:+轻度，记1分;++中度，记2分;+++重度，记3分;++++重度伴有坏死，记4分。②滑膜增生分3级:+轻度，记1分;++中度，记2分;+++重度，记3分。③血管翳形成:+记5分。④软骨破坏:+记10分。

2.4.3 ICAM － 表达分析

按照阴性(－):免疫反应阳性，产物无黄色记1分;轻度阳性(+):免疫反应阳性，产物呈淡棕黄色记2分;中度阳性(++):免疫反应阳性，产物呈棕黄色记3分;强阳性(+++):免疫反应阳性，产物呈深棕黄色记4分。

3 统计分析

正交分析按照直观分析及方差分析，各组间比较用F检验，前后自身比较用t检验。

4 实验结果

各组造模前后右足肿胀比较有明显差异，造模成功，各组间比较经统计学分析无差异，说明各组间有可比性［3］。

4.1 A－A大鼠足部病理切片的观察比较

各干预组大鼠病理镜下所见:第1组，滑膜重度增生，呈乳头样突出，炎性细胞浸润，血管翳形成，血管(炎)增生，炎性细胞浸润;第2组，滑膜上皮中度增生，组织粘连，血管增生，炎细胞浸润，血管翳形成;第3组，滑膜重度增生并水肿，可见有淋巴细胞，浆细胞大量浸润，组织坏死;第4组，滑膜上皮轻度增生，有炎细胞浸润;第5组，滑膜上皮轻度增生，炎细胞浸润;第6组，滑膜上皮中度增生，血管增生，炎细胞浸润;第7组，滑膜上皮重度增生，炎细胞浸润，血管上皮增生，纤维变性，血管翳形成;第8组，滑膜上皮轻度增生血管增生，炎细胞浸润;第9组，滑膜增生不明显，炎细胞浸润，血管增生。见图1～8。

统计分析:各病理严重程度按照前述的评分标准进行评分，取平均值相加，除以理论最大值即为各组的病理程度系数，系数越小，说明病变程度越轻，干预效果越好。列正交设计表及各组干预结果如表1。

图1 第1组血管翳形成×100

图2 第2组血管增生×100

图3 第3组组织坏死×400

图4 第4组滑膜上皮轻度增生×100

图5 第6组血管增生，炎细胞浸润×100

图6 第7组血管上皮增生，纤维变性×100

图7 第8组滑膜上皮轻度增生，血管增生×100

图8 第9组滑膜增生不明显，炎细胞浸润，血管增生×100

表1 各组病理评分系数正交分析表

由表1可见，对A－A大鼠病理干预因素的排列由大到小为A＞B＞C＞D，优化条件为A2B2C2D3。进一步做方差分析由于D值最小，将其作为误差进行比较，见表2。

表2 病理评分系数正交方差分析

根据极差分析的结果，优选方案为A2B2D3。

经F检验，只有A变异的P＜0.05，其余各变异无显著性差异，说明A因素是为干预的主要因素，取其较好值为A2;C、D因素差值极小，说明对病理的干预影响不大，几无影响，而C因素为A×B的影响，说明在本实验中二者交互作用不大，故B可以任选，B2、B3皆可选用;D因素的影响最小，比空列C的极差还小，说明在本次实验中所划分的病程没有对病理变化起到多大的影响，也许和病程之间的间距太短有关，这更加说明了RA是一个慢性而长期的病理过程。另外，A因素作为局部因素，结合消肿率的结果，说明局部治疗对A－A具有直接而重要的意义。故其优选方案为A2B(2，3可看情况任选)。

4.2 局部病理组织中ICAM－1的表达观察比较

ICAM－1显微镜下所见:病理切片按免疫组织化学染色后显微镜下观察，正常对照组双侧滑膜上皮及滑膜纤维膜呈阴性或微阳性表达。A－A大鼠左后足滑膜上皮及滑膜纤维膜均呈阳性表达，右足滑膜上皮及纤维膜也均成阳性表达，而以纤维膜的表达明显。其余治疗组均取右足。第1组见滑膜上皮及滑膜纤维膜阳性表达;第2组见滑膜上皮及滑膜纤维膜的表达，血管内皮也有表达;第3组，滑膜纤维膜表达阳性;第4组滑膜上皮及纤维膜成阴性表达;第5组滑膜上皮及纤维膜成阳性表达;第6组滑膜上皮及血管内皮阳性表达;第7组滑膜上皮及纤维膜呈阳性表达;第8组滑膜上皮有轻微表达;第9组滑膜上皮可见有弱阳性表达。见图9～13。

ICAM－1表达的分析比较，程度按照前述的评分标准进行评分，取小值为表达轻微。列正交表及各干预组评分结果如表3。

图9 模型组ICAM－1表达强阳性(右)×100深棕黄色

图10 正常对照ICAM－1表达阴性×100

图11 第3组ICAM－1表达强阳性×100呈深棕黄色

图12 第4组ICAM－1表达阴性×100

图13 第4组ICAM－1表达轻微×100

表3 ICAM－1表达评分正交分析表

表4 ICAM－1表达评分正交方差分析

从表3、4可以看到，经方差分析，各组均未取得显著意义，即各因素尚不能确定哪个为影响ICAM－1的主要因素;通过级差分析，可以直观看到影响ICAM－1的因素由大到小排列为A＞C＞B＞D，A因素级差最大，是为主要因素，取较好值为A3，其余各因素相差不大，可以任意取。按照极差分析的结果，可取A3C2B2D3。

5 讨论

类风湿关节炎(RA)是以慢性滑膜炎为特征，最终导致软骨吸收、骨破坏和骨纤维化的自身免疫性疾病。RA滑膜的特征性改变为:滑膜A型细胞增殖、T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞浸润、多形核细胞聚集以及滑膜成纤维细胞增殖和纤维沉积。其中T细胞激活是炎症的核心。随后引起一系列的炎症免疫反应，导致滑膜增生、血管翳形成、软骨侵蚀、变性坏死，这一过程是个慢性发展过程，很难完全阻断，但临床又有自行缓解的。在本次实验中，干预组仍存在不同程度的滑膜炎症，甚至有血管翳的形成，但可以看到干预组在病变程度上要比模型组轻微，且没有软骨病变形成，在一定程度上说明了针灸干预对于A－A大鼠的病变进程具有延缓作用。而以A2为最主要因素，说明局部的火针治疗对于改善局部病理状态具有重要价值。

上述炎症过程中粘附分子(Adhesion molecules，ADMS)起着重要的作用。首先，粘附分子可介导循环中的白细胞粘附于滑膜高内皮小静脉，并向血管外游出，聚集于滑膜，循环中的白细胞从血管移行到周围组织是关节急性炎症的一个标志，而慢性细胞免疫反应即淋巴细胞在关节滑膜的浸润则是RA的免疫学特征。在上述过程中，粘附分子充当重要角色。它是介导细胞间和细胞与胞外基质间相互结合的细胞表面受体，参与介导细胞迁移、淋巴细胞活化、吞噬及靶细胞杀伤等多种作用;其次，可促进细胞间的接触，并在抗原呈递和细胞激活过程中提供辅助刺激因子;第三，使白细胞粘附于细胞外基质成分并停滞在炎症局部［4］。炎症细胞一旦进入滑膜即产生一系列细胞因子，如TNF－a、IL－1β、IL－6等，造成滑膜炎性病变而破坏关节，上述细胞因子反过来又可通过上调内皮细胞表面粘附分子表达而招致更多的白细胞浸润［5］在早期RA患者，滑膜粘附分子表达的上调提示病情活动。

可以说ADMS影响着RA的4个病理期，国外Aori S等［6］发现，可溶性细胞粘附分子(sICAM －1)在RA患者外周血中的水平与其关节破坏的轻重程度呈正相关。近年来，许多学者探索用抗粘附分子或其受体的单克隆抗体治疗RA。动物实验和临床前期试验证实，粘附分子的单抗可以成功地阻断及减轻RA的严重程度［7］。Arthur认为其机理是抗ICAM－1的单抗可抑制炎症滑膜内皮细胞上的ICAM－1，因此能阻止T细胞进入滑膜。

ICAM－1可广泛表达于RA滑膜组织巨噬细胞样细胞、滑膜衬里细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，且较OA广泛［8］，本次实验发现针灸治疗对A－A大鼠病理局部的ICAM－1的表达具有一定的影响，随着病理程度的不同而ICAM－1的表达也发生改变，在模型组ICAM－1呈强阳性表达，治疗组除第1组外均较阳性组为轻微，并且有阴性表达。从微观的病理变化到直观的肿胀变化证实了针灸对RA治疗的有效性，针灸治疗下调了滑膜组织ICAM－1的表达，减轻了炎症反应，减缓了病理进程。

［1］华兴邦.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991(1):1－3

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