眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织BDNF表达影响*

王 哲，王守岩，王德山，马贤德，高 原，赵金茹，关洪全

(辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847)

脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一，缺血性脑血管病约占全部脑血管病患者的70% ～80%。脑缺血可诱导产生多种神经营养因子，它们可以与神经干细胞上的相应受体结合激活细胞内的信号系统，从而促进其分化，部分地替代和修复受损的神经元，从而在一定程度上改善神经功能缺损。脑源性神经营养因子(brain－derived neuro－trophic factor，BDNF)是神经营养因子家族重要成员之一，近来研究已表明BDNF在脑缺血/再灌注缺血周边区神经元的损伤修复中发挥了重要作用［1］。眼针疗法是我院著名老中医彭静山教授于70年代首创，在眼眶周围用针刺等刺激防治疾病的一种微针疗法。应用于临床30余年来，疗效显著。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察眼针对海马组织BDNF表达变化的影响，旨在探讨眼针治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康 SPF级 SD大鼠 32只，雌雄不拘，体重(280±20)g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号:SCXK(京)2007－0001。适应性喂养1周，自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。按随机数字法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、眼针组4组，每组8只。

1.2 模型制备与评价

参照文献［2］，模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。模型成功标准:大鼠于缺血2 h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照Longa 5分制评分标准［3］:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验，未达标准者排除。假手术组术式同模型、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1 cm。正常组未做处理。

1.3 眼针取穴及刺法

眼针组:用31号13 mm毫针，定位参照人体取穴方法［4］，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。于大鼠眶缘处，采用眶上横刺法，按照穴区定位线1→8的顺序，从该穴区定位线一端进针，横刺进针3 mm，到另一定位线，留针20 min，10 min时刮针1次，刮针5下。治疗时机:3 h眼针组于脑缺血再灌注即刻及取材前30 min分别进行眼针治疗2次。

图1 大鼠穴区定位图

1.4 试剂

实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。BDNF引物由北京华大基因公司合成。亲和纯化兔抗鼠BDNF多克隆抗体、DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 指标测定

海马组织BDNF蛋白表达(Western blot法):于缺血再灌注损伤3 h对大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，去掉小脑，沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开，剥离出病变侧海马，按海马组织净重:裂解液=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，PH值为7.5，将样品剪碎后匀浆、离心、上清即为总蛋白。兔抗鼠 BDNF一抗(1∶500);O－dianidine，βnaphthyl acid phosphate显色;扫描仪扫描NC膜，分析结果。

海马组织BDNF mRNA的表达:采用RQ－PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTACACGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAACATACGATT3'。β－actin为内参，其上下游引物分别为:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCGATAGTGA TGACCT 3'。所有的产物，在ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值，以管家基因β－actin为内参，以扩增倍数作为比较的依据，△CT=CT目的基因－CTβactin，△△CT=△CT实验－△CT对照，扩增倍数=2－△△CT。将所扩增的PCR产物同时进行溶解曲线分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 眼针对急性脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠神经缺损评分影响

模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等;假手术组大鼠无神经功能障碍表现。模型组造模后即刻与眼针组造模后即刻及模型组再灌注损伤3 h后神经功能缺损评分无差异，眼针组再灌注损伤3 h后与造模后即刻神经功能缺损评分有差异(P＜0.01)。见表1。

表1 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后神经缺损评分影响

2.2 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠海马组织BDNF蛋白表达的影响

图2、表2为采用Western blot方法检测结果:取大鼠右侧海马组织检测BDNF蛋白，以β－actin为内参，模型组海马组织BDNF蛋白表达明显低于正常组和假手术组，眼针组BDNF蛋白表达明显高于模型组(P ＜0.01)。

表2 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠海马组织BDNF蛋白表达影响

图2 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠组织BDNF蛋白表达影响

2.3 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠海马组织BDNF mRNA表达的影响

采用实时定量PCR方法检测海马组织BDNF mRNA表达如图3、4、5所示，本实验选用β－actin作为内参，BDNF基因扩增产物大小为86 bp，β－actin基因扩增产物为132 bp。模型组海马组织BDNF mRNA表达较正常组、假手术组减少，眼针组表达较模型组增高，均有显著差异(P＜0.01)。

3 讨论

随着人口老龄化程度的加剧，脑血管疾病已成为倍受社会关注的问题。脑缺血是脑血管疾病主要病种，在我国，其死亡率仅次于恶性肿瘤，是对人类健康威胁十分严重的一类疾病，所以在临床上如何减轻脑组织的损伤、保护神经细胞免受损伤成为研究的热点问题。中医认为中风病的发生与肝、脾、肾三脏功能失调有关，其表现为口眼喎斜、舌强语蹇、半身不遂。中风治疗的各个时期均可采用针灸疗法，并取得肯定疗效［5］。人体经络直接或间接与眼相连。正如《灵枢·邪气脏腑 》曰:“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍，其经阳气上走于目而为睛。”《灵枢·经脉》曰:“诸脉皆属于目。”眼与脏腑关系密切，眼的正常功能依赖五脏六腑之滋养。据此，我校著名老中医彭静山先生结合眼与经络、脏腑的关系，经过长期临床实践，创立了眼针疗法，在白睛脉络异常部位的眼眶内针刺治疗，常常收到奇效。另有研究结果表明眼针疗法对脑供血不足患者治疗效果确切显著，是一种简便有效、无不良反应、易于推广的疗法［6］。但是眼针治疗中风病等的机制是否与BDNF表达变化有关尚未见报道。

图5 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠海马组织BDNFmRNA表达影响

BDNF是神经营养因子家族成员之一。脑缺血后BDNF蛋白和其mRNA的表达均会发生相应改变。Lee等发现缺血1周后可见年轻大鼠海马CA区和皮层内 BDNF蛋白的表达明显增加［7］。BDNF是由Barde等［8］在1982年从猪脑中首先分离和纯化，属于神经生长因子家族成员，在维持神经元功能及其损伤后再生修复方面发挥着重要作用，体外及体内实验研究均证实BDNF在神经元存活、神经发生分化和增殖以及学习、记忆等方面扮演着重要的角色［9］。BDNF由神经细胞合成并广泛分布于中枢神经系统，以大脑皮质、海马、纹状体分布最为丰富。

本实验通过眼针刺激缺血再灌注损伤模型大鼠，根据肝肾阴虚为中风病的基本病机之一，偏瘫的上、下肢分别归属上焦区、下焦区，眼针取肝区、肾区以滋补肝肾治病求本，取上焦区、下焦区以活血通络治其标，结果显示缺血再灌注损伤3 h眼针组BDNF的蛋白表达及基因表达均较模型组升高，同时眼针组大鼠神经功能缺损较模型组减轻，说明眼针刺激能上调病变侧海马组织BDNF的表达，减轻脑缺血再灌注损伤。表明眼针刺激肝区、肾区、上焦区、下焦区，可能是通过调节BDNF的表达，促进神经元的损伤修复来减轻脑缺血再灌注损伤。

［1］刘崴，程焱，王虔.脑源性神经营养因子与缺血性脑损伤［J］.国外医学·脑血管疾病分册，2004，12(6):433－436

［2］马贤德，孙宏伟，柴纪严，等.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究［J］.中华中医药学刊，2009，27(6):1200 －1201

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91

［4］彭静山.眼针疗法［M］.沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11

［5］田维柱.中华眼针［M］.沈阳:辽宁科学技术出版社，1998:78－88

［6］李志.眼针改善慢性脑供血不足患者认知功能障碍［J］.中国针灸，2009，29(10):791 －793

［7］Lee TH，Yang JT，Kato H，et al.Expression of brain － derived neurotrophic factor immunoreactivity and mRNA in the hippocampal CA1 and cortical areas after chronic ischeia in rats［J］.J Neurosci Res，2004，76(5):705 －712

［8］Barde Y A，EdgarD，Thoenen H.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain［J］.J EMBO，1982，1:549 －553

［9］Marini A M，J iang X，Wu X，et al.Preconditioning and neurotophins:amodel for brain adaptation to seizures，ischemia and other stressful stimuli［J］.Am ino Acids，2007，32:2992304