鳖甲多肽的全合成及对肝星状细胞的作用

胡春玲，唐尹萍，施静妮，刘焱文

(湖北中医药大学中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，武汉 430065)

鳖甲(Trionyx sinensis carapace)为传统中药，来源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。临床上，以鳖甲为君药的多种中药复方用于治疗肝纤维化疗效显著。单味鳖甲也常用于治疗慢性肝病，预防肝硬化，是临床上治疗肝硬化应用最广的药物之一［1-2］。笔者前期研究工作已证实鳖甲煎煮液对大鼠肝纤维化有较好的抑制作用［3］，并首次从鳖甲中分离出活性成分，药理实验证明其抗肝纤维化效果显著［4-8］，但其来源有限，应用受到极大限制。笔者在本实验中选取鳖甲活性成分之一抗肝纤维化活性多肽(NPNPT，m/z 542.16)进行多肽固相合成，经反相高效液相分析、纯化得到鳖甲合成多肽;并应用Annexin VFITC/PI流式细胞术检测鳖甲合成多肽作用肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)后细胞凋亡情况［9-10］，为筛选、寻找抗肝纤维化多肽药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilent1100液相色谱仪(Agilent公司);基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(日本岛津公司);台式冷冻干燥机;二氧化碳(CO2)培养箱(日本SANYO公司产品);倒置相差显微镜(日本Olympus公司产品);EEPICSXL型流式细胞仪(美国BECKMANCOUNTER公司)。

1.1.2 试剂 大鼠肝星状细胞系(HSC-T6，浙江大学附属第一医院肝病研究所提供);High-DMEM培养基(美国GIBCO公司);胎牛血清(武汉三利生物技术有限公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒(美国罗氏公司);Na-芴甲基氧羰基保护的氨基酸(Fmoc-AA)、Wang树脂、1-氧-3-双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU，吉尔生化上海有限公司生产);其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 鳖甲活性多肽的固相合成 根据鳖甲NPNPT的氨基酸序列结构，采用固相合成法，以Fmoc保护氨基酸和Wang树脂为原料，经1-氧-3-双二甲胺羧基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、N-甲基吗啡啉(nmethylmorpholine，NMM)缩合，以20%哌啶的二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)溶液进行脱保护，用TFA切割试剂将多肽粗品从Wang树脂上切割下来。

1.2.2 细胞培养 将HSC-T6培养于含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1链霉素和 1%NEAA的High-DMEM培养液中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、饱和湿度的细胞培养箱中培养;在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度80%～90%时，是HSC-T6传代的标志;吸弃培养基，加入0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按1∶4传代。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测早期细胞凋亡 取对数生长期细胞，以1×105个·mL-1密度接种于50mL培养瓶中，24 h后加入含2%胎牛血清的DMEM培养液配制的各浓度鳖甲合成多肽(0，0.6，1.2，2.5，5.0 mg·mL-1)培养24 h，收集所有细胞，根据 Annexin V-FITC/PI试剂盒说明，流式细胞仪检测HSC凋亡。以加入鳖甲合成多肽浓度0 mg·mL-1组为对照组。

2 结果

2.1 鳖甲合成多肽的鉴定结果 采用经典的多肽固相合成方法，按照鳖甲抗肝纤维化活性多肽的氨基酸序列从右到左进行全合成，经反相高效液相色谱分析纯化，得纯度＞98%的合成肽。其质谱图见图1。由图可以得到合成多肽的相对分子质量为542.083，与对应鳖甲抗肝纤维化活性多肽NPNPT(m/z为542.16)的理论相对分子质量一致，证明合成多肽即为目的产物。

图1 合成多肽N-P-N-P-T的质谱鉴定图Fig.1 Mass spectrum analysis of synthetic peptide N-PN-P-T

2.2 鳖甲合成多肽对 HSC早期凋亡的影响Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，0.6，1.2，2.5和 5.0 mg·mL-1鳖甲合成多肽与 HSC-T6细胞作用24 h后，早期凋亡率分别为(9.56±1.27)%，(28.90±3.11)%，(57.96±5.17)%和(87.17±10.85)%，与空白对照组［早期凋亡率(2.85±0.58)%］比较，均明显增高;高剂量组之间凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

3 讨论

图2 流式细胞术检测鳖甲合成多肽对HSC-T6早期凋亡的影响A.空白对照组;B.鳖甲合成多肽 0.6 mg·mL-1组;C.鳖甲合成多肽 1.2 mg·mL-1组;D.鳖甲合成多肽 2.5 mg·mL-1组;E.鳖甲合成多肽 5.0 mg·mL-1组;Fig.2 Detection of apoptosis of HSC-T6induced by synthetic peptide of Carapax Trionycis by flow cytometryA.blank control group;B.0.6 mg·mL-1synthetic peptide group;C.1.2 mg·mL-1synthetic peptide group;D.2.5 mg·mL-1 synthetic peptide group;E.5.0 mg·mL-1synthetic peptide group

以鳖甲抗肝纤维化活性成分为先导化合物，进行全化学合成，是当今寻找安全、高效抗肝纤维化药物的重要途径。本实验结果表明，根据鳖甲抗肝纤维化活性多肽的序列结构，采用Fmoc固相方法对多肽进行全合成，经反相高效液相色谱法分析、纯化得到纯度高、相对分子质量为与理论值一致的合成多肽，说明通过全合成的方法完全可以得到与天然多肽结构一致的鳖甲合成多肽。

HSC在肝纤维化的发生发展过程中发挥关键作用［11-12］，有效干预HSC的生物学行为则能成功防治肝纤维化，其中诱导活化的肝星状细胞凋亡是目前治疗肝纤维化的主要机制之一，Annexin V-FITC/PI双染法是常见的定量检测细胞凋亡的方法。本实验经Annexin V-FITC/PI法检测HSC凋亡，发现鳖甲合成多肽可以诱导HSC的凋亡，抑制HSC增殖，发挥抗肝纤维化的功能，且其作用呈剂量依赖性。总之，通过鳖甲多肽的固相合成及Annexin V-FITC/PI法检测鳖甲合成多肽诱导HSC凋亡，为目前筛选、寻找抗肝纤维化多肽药物提供理论依据。

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