酶联免疫法快速检测贝类中腹泻性贝类毒素

黄玉柳，黄国秋，叶欣宇，黎小正，吴祥庆，杨姝丽，吴明媛

(广西水产研究所，广西 南宁 530021)

腹泻性贝类毒素(Diarrhetic shellfish poisons，DSP)是由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属中部分藻种产生的一类脂溶性天然化合物，主要成分为软海绵酸及其衍生物。有毒藻经双壳贝类滤食后，其毒素会在贝体内累积，导致贝类食用者中毒，出现腹泻、恶心、呕吐及肠胃绞痛等症状。

目前，用于DSP检测的方法主要有小鼠生物法、酶联免疫法、细胞毒性测试法、酶活力抑制分析法、高效液相色谱法以及液相色谱-质谱联用等方法[1，2]。食品检验部门常用小鼠生物法进行DSP检验，但由于该方法对小鼠品种(品系)的要求较高，毒素提取过程复杂，易受杂质干扰，且变异性较高，因而检测的准确性和专一性较差，不利于调查追踪污染源以及对染毒贝类进行早期临控和预警。酶联免疫检测方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是利用抗体和抗原的特异性结合反应建立的免疫化学方法，其灵敏度高、成本低、特异性强、仪器要求不高、样品前处理简单，特别适于现场监测和大量样本快速筛查，近年来在分析化学领域得到迅速发展。作者在此介绍了美国ABRAXIS腹泻性贝类毒素试剂盒的测定方法，并和传统的小鼠生物法进行了比较。

1 实验

1.1 样品来源

分别于广西钦州和防城港海域近江牡蛎养殖场采集近江牡蛎样品20个，于北海海域文蛤养殖场采集文蛤样品20个，共60个样品。样品采集后立即置于冰排中存放，当日送回实验室检验。

1.2 主要试剂与仪器

美国ABRAXIS腹泻性贝类毒素试剂盒，甲醇。实验用水为蒸馏水。

酶标比色仪 (BIO-TEK)，离心机，均质器。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

试剂盒中提供的DSP标准溶液浓度为0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb。结果分析可采用商业ELISA分析软件(4-Parameters，Logit/Log)或手工计算。以每个标准溶液的B/B0为纵坐标(B和B0分别为各标准溶液的吸光度、零标准溶液的吸光度)、冈田酸浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理

首先除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质。称取1 g 均质后的样品加入6 mL80%(体积分数)甲醇，3500 r·min-1离心10 min，收集上清液；加2 mL 80%甲醇到残留贝肉组织中，再次3500 r·min-1离心10 min，收集上清液；重复以上步骤，待收集的上清液达到10 mL时，用0.45 μm的滤膜过滤；取10 μL滤液，用缓冲溶液稀释到1 mL。

1.3.3 试剂盒的测定程序

依次在预包被抗体的微孔板中加入浓度分别为0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb的DSP标准溶液和样品提取液各100 μL。每个测试孔加入50 μL冈田酸酶标记物溶液、50 μL冈田酸抗体溶液，用封口膜盖上微孔板，轻轻振荡微孔板30 s，使液体混匀。室温下孵育60 min。孵育完成后，取掉封口膜，将微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL 1X的洗液。拍板，去掉残留的洗液。每个测试孔加入150 μL显色液(底物)。室温避光孵育20～30 min。每个测试孔加入100 μL反应终止液。用酶标测定仪在450 nm处测量吸光度值。通过标准曲线计算样品中DSP的含量。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线(图1)

图1 标准曲线

2.2 方法灵敏度和检测限

本方法灵敏度为1.7 ppb。根据样品处理稀释系数，检测限为0.1 ppb。

2.3 样品检测

样品检测结果表明，钦州近江牡蛎DSP平均含量为21 ppb；防城港近江牡蛎DSP平均含量为34 ppb；北海文蛤DSP平均含量为23 ppb。

2.4 ELISA法和小鼠生物法检测DSP的比较(表1)

表1 ELISA法和小鼠生物法的比较

从表1可以看出，ELISA法检测限远远低于小鼠生物法，日常管理中可通过ELISA法快速检测筛查，更加及时地向管理部门提供食品风险预警信息，有效地控制赤潮毒素造成的影响，减少损失，避免由此带来的食品卫生风险；同时，在检出可能染毒的贝类时，及时将贝类转移到清洁水体中进行一定时间的净化，使其体内的毒素含量降低到可以食用的水平。

3 结论

采用美国ABRAXIS腹泻性贝类毒素(DSP)试剂盒对广西钦州和防城港海域近江牡蛎各20个样品、北海海域文蛤20个样品进行了DSP检测。全部检测过程在2 h内完成，检测限为0.1 ppb，灵敏度为1.7 ppb。ELISA法检测操作方便、成本低，检测限和灵敏度均满足要求，非常适于快速检测，有望作为理想的DSP筛选分析方法之一，在水产品质量快速检测、养殖区染毒情况调查以及上市贝类质量监控方面发挥重要作用。

[1] 曹际娟，卫锋，马惠蕊，等.贝类毒素检测技术及研究进展[J].检验检疫科学，2004，14(1)：53-56.

[2] 葛虹.贝类毒素的检测[J].渔业致富指南，2008，(12)：36-37.