林可霉素生物合成基因簇中调控基因lmbU的功能研究

陈 林,王增亮,赵群飞,高淑红,叶蕊芳

(1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.中国科学院上海有机化学研究所，上海 200032)

林可霉素(Lincomycin)是由林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)产生的第一代林可酰胺类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌所引起的感染。因其对组织和细胞穿透力强，应用方便(不需皮试)，广泛应用于临床[1，2]。我国自1975年工业生产林可霉素以来，通过菌种选育和工艺改进，生产水平不断提高，但仍然与国际先进水平存在较大的差距。

近年来，随着基因组学和DNA重组技术的快速发展，人们可以合理、定向且高效地对微生物细胞内生物合成相关的基因进行遗传改造。相比盲目、随机的传统诱变方法(如自然选育、诱变育种、原生质体融合等)，合理的遗传改造更能特异地提高目标产物的产量和纯度。

遗传改造的关键是在基因和蛋白功能水平上认识和理解复杂天然产物的生物合成和调控机制。早在20世纪90年代，35 kb包含完整林可霉素生物合成基因簇的DNA序列就已被克隆[3，4]，但到目前为止，对林可霉素生物合成基因功能的相关研究仍然很少，基本上都局限在序列比对和生物信息学分析基础上进行的推测。

根据对林可霉素生物合成基因的生物信息学分析，推测该基因簇中的基因lmbU是林可霉素生物合成的调控基因。作者采用同框敲除和基因倍增的方式对S.lincolnensisN9的lmbU基因功能进行初步的研究，为遗传改造林可霉素生产菌以提高林可霉素的产量做出有益的探索。

1 实验

1.1 菌种与质粒

林可链霉菌S.lincolnensisN9，自行保藏；大肠杆菌E.coliDH5α、E.coliET12567(pUZ8002)[5]、克隆质粒pSP72、温敏性质粒pKC1139[6]、整合型载体pSOK804[7][含有接合转移复制子oriT和安普霉素Apramycin抗性基因aac(3)IV]、质粒pLL6214(携带红色糖多孢菌红霉素强启动子ermE*)，中科院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室。分子生物学常规操作方法参照文献[8]。

1.2 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基：10.0 g胰蛋白胨，10.0 g酵母抽提物，5.0 g氯化钠，蒸馏水定容至1 L。固体培养基另加20.0 g琼脂。

TSB培养基：30 gTSB，蒸馏水定容至1 L。

MS培养基：20.0 g黄豆饼粉，20.0 g甘露醇，20.0 g琼脂粉，自来水定容至1 L。

1.3 重组质粒pLIN-DU、pLIN-U的构建

1.3.1 引物设计

根据2008年6月公布的S.lincolnensisATCC 25466林可霉素生物合成基因簇序列信息(Accession No.EU 124663)设计相关引物。PCR克隆基因lmbU左臂所用引物为UL-F：5′-ATAGAATTC(EcoRⅠ)CCTGGAGGTAGTGGAACGCG-3′，UL-R：5′-ATAAAGCTT(HindⅢ)GGCACATCGCGTCGGAGTAC-3′；PCR克隆基因lmbU右臂所用引物为UR-F:5′-ATAAAGCTT(HindⅢ)GTCGCTGTACCGGGTCTGAC-3′，UR-R：5′-ATATCTAGA(XbaⅠ)CGACAGGCTCAGGAATCGGC-3′。

同时，为了利用lmbU基因自身的启动子，设计引物时往基因lmbU上游延伸了200 bp左右。获取基因lmbU的上游引物LIN-4-F：5′-GCTCTAGA(XbaⅠ)GCAATGATGCTGGTTCCGCCAAGC-3′和下游引物LIN-4-R：5′-CCCAAGCTT(HindⅢ)ACTAGT(SpeⅠ)GTGGAGGTGATGGCTGGTGGGCAG-3′。

1.3.2 质粒构建过程

PCR扩增反应在Eppendoff热循环仪上进行，条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃继续延伸10 min；采用1%的琼脂糖凝胶电泳回收目标条带；将EcoRⅠ/HindⅢ酶切后的左臂UL(1.77 kb)、HindⅢ/XbaⅠ酶切后的右臂UR(1.74 kb)、XbaⅠ/HindⅢ酶切后lmbU基因片段(0.95 kb)分别连入pSP72相应位点后获得重组克隆质粒pCLDU-1、pCLDU-2、pCLU-1，由英骏生物技术有限公司测序验证。

用限制性酶EcoRⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/HindⅢ分别从测序正确的克隆质粒pCLDU-1和pCLDU-2上酶切下左臂UL和右臂UR，克隆至EcoRⅠ/XbaⅠ酶切后的pKC1139质粒上，获得重组质粒pLIN-DU(如图1所示)。同理，用限制性酶XbaⅠ/HindⅢ从测序正确的克隆质粒pCLU-1上酶切下lmbU基因片段，克隆至XbaⅠ/HindⅢ酶切后的pLL6214质粒上，获得质粒pCLU-2；再用EcoRⅠ/HindⅢ酶切下1.44 kb含红霉素启动子和lmbU基因的目的片段，克隆至EcoRⅠ/HindⅢ酶切后的pSOK804载体上，获得重组质粒pLIN-U(如图2所示)。

图1 重组质粒pLIN-DU的构建

图2 重组质粒pLIN-U的构建

1.4 突变菌的获得与验证

将构建正确的重组质粒pLIN-DU、pLIN-U分别转化到大肠杆菌E.coliET12567(pUZ8002)中，通过属间接合转移[9]方式导入到S.lincolnensisN9。获得接合子之后，用于中断lmbU基因的接合子在Am抗性筛选条件下37 ℃培养，利用pKC1139质粒上的温敏性复制子，促使质粒与链霉菌基因组发生第一次同源重组，然后置于无抗条件下30 ℃松弛培养2～3代，使两者发生第二次同源重组，获得发生双交换后的突变菌LIN-DU；用于倍增lmbU基因的接合子依照pSOK804载体上的整合特点可直接视为突变菌LIN-U。

获得突变菌后，用引物DU-F：5′-GGTCATG GAGGCGGATGTTG-3′ 和DU-R：5′-CGGTGA CCCAAAGGGCAAGA-3′以及引物PermE-F：5′-GAATTCGGTACCAGCCCGACCCGAG-3′和LIN-4-R对突变菌LIN-DU、LIN-U分别进行PCR验证。

1.5 突变菌的发酵验证

突变菌发酵采用二级培养的方法。以出发菌S.lincolnensisN9为对照，于30 ℃、220 r·min-1下摇瓶发酵，在种子培养基中培养2 d后转接入二级发酵培养基，发酵7 d。为判断不同基因型对林可霉素生物合成造成的差异，对于突变菌和出发菌采用相同的发酵条件，尽量减少发酵过程对其表型的影响。

1.6 分析与检测

发酵液效价测定采用杯碟法。

LC-MS检测条件：采用Phenomenex Luna 5u C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)；检测波长为210 nm；流动相为5 mmol·L-1乙酸铵水溶液∶甲醇(40∶60)；恒梯度洗脱，流速为0.6 mL·min-1；进样量为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒pLIN-DU、pLIN-U的验证

获得重组质粒pLIN-DU、pLIN-U后，分别用XhoⅠ和BglⅡ两组单酶切体系、EcoRⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/HindⅢ两组双酶切体系进行酶切验证，结果如图3所示。

M.DNA Marker DL5000 1,2.pLIN-DU 3,4.pLIN-U

用XhoⅠ单酶切pLIN-DU会形成大小分别为6.72 kb和3.30 kb的目标条带，用BglⅡ单酶切pLIN-DU会形成大小分别为7.92 kb和0.90 kb的目标条带。由图3A可知，lmbU左右臂拼接的片段(UL和UR)成功插入质粒pKC1139中。

用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切pLIN-U会形成大小分别为6.04 kb和1.43 kb的目标条带；而用XbaⅠ/HindⅢ双酶切pLIN-U会形成大小分别为3.61 kb、2.33 kb和0.94 kb的目标条带。由图3B可知，外源重组基因片段ermE*+lmbU成功插入载体pSOK804中。以上验证结果表明重组质粒pLIN-DU、pLIN-U均可用于后续遗传操作。

2.2 突变菌LIN-DU、LIN-U的PCR验证

图4 突变菌LIN-DU的同框敲除示意图

重组质粒pLIN-DU导入出发菌S.lincolnensisN9中会与染色体发生两次同源重组(原理如图4所示)从而使得lmbU基因内部序列缺失195 bp。因此，可通过在基因lmbU左右臂内部设计一对引物DU-F和DU-R对突变菌进行PCR验证。若是野生型或回复突变型菌株，染色体上lmbU基因是完整的，PCR扩增的条带大小约为1.10 kb左右；而突变菌LIN-DU染色体上lmbU基因内部序列有缺失，PCR只能扩增出大小约为0.90 kb左右的条带。PCR验证结果如图5所示。

而重组质粒pLIN-U导入出发菌S.lincolnensisN9中后，外源重组片段ermE*+lmbU会随着载体pSOK804与染色体上特异位点的整合而一并插入菌株染色体中。可利用外源重组片段ermE*+lmbU两端的引物PermE-F和LIN-4-R对突变菌的总DNA进行PCR验证。若是质粒成功导入出发菌株，则会扩增出大小约为1.66 kb的目标条带，而出发菌株S.lincolnensisN9则不会。PCR验证结果如图5所示。

M.DNA Marker DL5000 1.突变菌LIN-DU的总DNA 2，3.出发菌S.lincolnensis N9的总DNA 4.突变菌LIN-U的总DNA

由图5可知，PCR验证实验结果与预想的完全一致，突变菌LIN-DU中lmbU基因内部序列发生了缺失、突变菌LIN-U中成功倍增了lmbU基因，均可用于后续的发酵验证。

2.3 突变菌LIN-DU、LIN-U的发酵验证

对照菌N9、突变菌LIN-DU、LIN-U发酵液效价测定结果如图6所示。由图6可知，对照菌N9的效价为3204 U·mL-1，突变菌LIN-DU、LIN-U的效价分别为100.30 U·mL-1、3219 U·mL-1。由于突变菌LIN-DU杯碟法测其效价非常低，又对其发酵液进行了LC-MS测定，结果如图7所示。由图7可知，突变菌LIN-DU仍产生微量的林可霉素A(质荷比为407)，但产量较出发菌株S.lincolnensisN9明显下降，仅为出发菌株的1/30。

图6 对照菌N9、突变菌LIN-DU、LIN-U发酵液效价测定结果

图7 突变菌LIN-DU和对照菌S.lincolnensis N9 LC-MS图谱对比

以上表型结果表明，lmbU为林可霉素生物合成的正调控基因，但单独倍增lmbU基因对于林可霉素产量和组分比例影响不显著。

2.4 讨论

有文献报道，lmbU基因敲除能够使S.lincolnensis野生菌株失去林可霉素生物合成能力，lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因[10]。作者通过序列分析，发现lmbU基因与几种抗生素产生菌中调节基因具有很高的同源性。

本研究通过对lmbU基因的同框敲除，发现得到的突变菌的林可霉素产量明显下降，LC-MS分析表明其仍能产生微量的林可霉素，证明lmbU基因是负责林可霉素生物合成的正调控基因。同时尝试对lmbU基因进行倍增以提高林可霉素的产量，结果表明得到的突变菌的林可霉素产量没有明显提高。可能lmbU基因并非是途径特异性的调节基因，而是处于一个相对复杂的调控环境中，有待于进一步探索和研究。

3 结论

研究了林可霉素生物合成基因簇中调控基因的功能。通过构建重组质粒pLIN-DU和pLIN-U分别对林可霉素工业生产菌株Streptomyceslincolnensis的lmbU基因进行同框敲除和基因倍增，获得相应突变菌LIN-DU和LIN-U后，对突变菌发酵液进行生物效价测定和LC-MS分析，探讨lmbU基因对林可霉素产量和组分的影响。结果发现，基因敲除突变菌LIN-DU的林可霉素生物合成能力大幅削弱；基因倍增突变菌LIN-U的林可霉素生物合成相对出发菌株没有明显变化。表明lmbU基因对林可霉素生物合成具有正向调控作用。

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