应用荧光微球技术进行免疫检测研究

张燕玲，陈 超，杨 慧，薛小平

(1.西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072;2.国家微检测系统工程技术研究中心，陕西 西安 710069)

微球技术的雏形最早可追溯到20世纪70年代，Horan等采用两种大小不同的微球在流式细胞仪上同时对两种抗体进行免疫分析[1]；McHugh等又用4种不同直径的微球同时检测血清中相应的HIV抗体[2]。随后研究发现，仅靠识别微球大小来检测，远远不能满足高通量和高灵敏度检测的需要。近年来，Luminex公司在微球合成过程中加入红色和橙色荧光染料，通过调节两种荧光染料的比例获得不同颜色的微球，即给每种颜色的微球一个地址，开发出荧光可寻址微球(Fluorescent addressable microsphere)，弥补了以往多元检测模式的不足[3]。在此基础上发展出的荧光微球技术(Fluorescent microsphere-based technology)是将聚苯乙烯羧基微球、荧光染料标记系统、激光技术、应用流体学及微球专用流式细胞仪等有机整合在一起的一项新技术，通过荧光微球信号来进行实验数据采集和分析，具有快速分析多重生物反应的特点及高灵敏度和特异性，可用于抗原抗体、核酸探针检测等领域的研究[4，5]。作者在此通过检测人免疫球蛋白G(IgG)和猪血红蛋白(Hb)与荧光微球的偶联效率，提示荧光微球技术可应用于免疫检测。

1 实验

1.1 材料和仪器

111#和172#聚苯乙烯荧光微球、荧光亲和素SA-PE，Luminex公司；人免疫球蛋白G(IgG)、生物素化羊抗人IgG(Biotin-羊抗人IgG)、猪血红蛋白(Hb)、兔抗猪血红蛋白多克隆抗体(Hb-PcAb)，北京鼎国生物技术有限责任公司；Biotin-NHS，CALBIOCHEM公司；碳二亚胺(EDC)，PIERCE公司。

Luminex-100TM荧光微球检测系统，Luminex公司；Millipore MultiScreen Assay System，Millipore公司；8543型紫外可见分光光度计，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 生物素标记Hb-PcAb

将Biotin-NHS溶解于DMSO，加入抗体Hb-PcAb，按VBiotin-NHS∶V抗体=1∶8比例混合避光反应，用PBS透析后加入等体积甘油，-20 ℃保存[6]。

1.2.2 紫外可见分光光度计检测IgG和Hb与荧光微球偶联效率

超声波水浴振散微球后向每管分别加入20 μL 172#和111#微球(172#微球与IgG偶联，111#微球与Hb偶联)，迅速配制50 mg·mL-1的EDC溶液加入微球中，混匀，于室温避光温育20 min，PBS清洗微球2次[7]；加入浓度(μg·mL-1)为25、50、100、150、200、250的IgG或Hb溶液各500 μL，紫外可见分光光度计检测不同浓度IgG和Hb溶液吸光值，记为OD0；空白对照管加入500 μL PBS，混匀，于室温避光振动温育2 h后，离心，测上清液吸光值，记为OD1；再用PBS清洗微球2次，离心后测上清液吸光值，分别记为OD2和OD3；最后重悬微球，于4 ℃下避光保存。偶联效率由下式计算：

1.2.3 Luminex-100TM检测IgG和Hb与荧光微球偶联效率

将Biotin-羊抗人IgG和生物素标记Hb-PcAb分别按1∶1000、1∶5000、1∶10 000、1∶100 000稀释，与172#、111#微球各2 μL(约6000个)混合后加入96孔不透光板中，室温避光温育30 min，PBS清洗微球2次，然后加入荧光亲和素SA-PE(1∶10稀释)于室温避光温育30 min，用Luminex-100TM检测偶联效率，结果由平均荧光强度(Mean fluorescent intensity，MFI)表示。

2 结果与讨论

2.1 紫外可见分光光度计检测蛋白偶联效率结果(表1)

表1 紫外可见分光光度计检测IgG、Hb与荧光微球偶联效率结果

由表1可看出，IgG和Hb与荧光微球偶联效率随蛋白浓度增大而提高，在100 μg·mL-1时达最大，随后呈下降趋势。

2.2 Luminex-100TM检测蛋白偶联效率结果(图1、图2)

图1 Luminex-100TM检测IgG与172# 荧光微球偶联效率结果

图2 Luminex-100TM检测Hb与111# 荧光微球偶联效率结果

由图1和图2可以看出，IgG和Hb在6种浓度梯度下偶联所得荧光值均较高，说明荧光微球检测技术非常灵敏，偶联效率都较为理想；空白1(Blank1)为未偶联任何蛋白的空球；空白2(Blank2)为偶联Hb和IgG的微球(未加生物素化检测抗体)，提示这6种浓度梯度对偶联效率影响均不大。在保证偶联效率较高且不浪费抗原或抗体的前提下，宜选择100 μg·mL-1作为偶联蛋白的浓度。

2.3 讨论

目前免疫学检测方法有酶扩大免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光偏振免疫测定(FPIA)等技术[8，9]。荧光微球技术是近年来产生和发展的一项新技术，与传统流式细胞技术和ELISA等检测技术相比，在检测灵敏度、效率、应用范围等方面具有显著的优越性，随着微球技术和生物芯片技术的不断成熟和发展，将有可能广泛应用于生命科学。本研究以人免疫球蛋白G和猪血红蛋白作为抗体和抗原代表与荧光微球偶联，从检测结果可以看出荧光微球非常易于与蛋白偶联且稳定性较好，提示该技术如应用于微生物、细胞因子、兴奋剂筛查等各种高通量快速免疫检测反应[10～12]，将具有十分广阔的应用前景。

3 结论

以聚苯乙烯羧基荧光微球为固相载体，将人免疫球蛋白G(IgG)和猪血红蛋白(Hb)分别与微球偶联，应用Luminex-100TM荧光微球检测系统检测抗体IgG和抗原Hb与荧光微球的偶联效率。结果表明，采用100 μg·mL-1抗体或抗原浓度可以获得较高的偶联效率，且检测快速灵敏。应用荧光微球进行抗原抗体免疫检测可行。

致谢：本研究由国家微检测系统工程技术研究中心资助完成。

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