润滑油生物降解菌的筛选

沈齐英，艾 娃，林家柱，王 隆

(北京石油化工学院化工系，北京 102617)

目前全世界使用的润滑油中，除部分由机械运转正常消耗、部分回收再生利用外，在装拆、灌注、机械运转过程中仍有4%～10%的润滑油流入环境，仅欧共体每年就有60万t润滑油由于各种原因流失在环境中。以矿物油作基础油的传统润滑油产品，在自然环境中可生物降解能力差、滞留时间长，对环境造成破坏。

针对润滑油造成的环境污染，世界各国都相继进行了环境兼容润滑油的研究，并积极研究石油基润滑油的生物降解。所谓环境兼容润滑油是指润滑油在满足机器工况要求的同时，润滑油及其耗损产物对生态环境不造成危害或在一定程度上为环境所容许，即其生态效应合格，其生态效应最主要的指标是润滑油的生物降解性。目前为止还没有一个普遍接受的测定润滑油生物降解性的标准。国外在润滑油生物降解性测试方法方面进行了大量的研究工作，先后发展出OECD、CEC-L-33-A-93等较成熟的测试方法。但用于评价润滑油污染环境的实际状况时还存在一定的不足，因此研究者正在对上述测试方法进行进一步的完善和发展，同时也在探索新的测试方法来评定润滑油的生物降解性[1～3]。

作者从被石油基润滑油污染的土壤中筛选获得对润滑油具有一定降解能力的菌株，并研究了菌株的生长特性，期望能为润滑油生物降解性的评价提供可借鉴的数据及方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

菌源取自燕山石化被石油基润滑油污染的土壤；润滑油，燕山石化。

石油醚、葡萄糖和蔗糖，分析纯，北京化工厂；苯胺，分析纯，北京兴津化工厂；蛋白胨、酵母粉和牛肉膏，北京博奥星生物技术有限责任公司。

无机盐培养基、基本培养基、普通培养基和富集培养基，参照文献[4]配制。除无机盐培养基和基本培养基外，其余的培养基在使用时均经过0.15 MPa、121 ℃的蒸汽灭菌20 min。

AC2型生物安全柜，ESCD公司；sp-3000型紫外分光光度计，上海光学仪器厂；LGR10-4.2型冷冻离心机，北京医用离心机厂；SPH-2102C型恒温振荡培养箱，上海世平实验设备有限公司；DSX-280B型不锈钢灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 润滑油降解菌的驯化、分离和保存

取5 g被润滑油污染的土壤充分溶于100 mL生理盐水中，取10 mL接种于90 mL无机盐培养基和10 mL润滑油的混合液中，混合液置于恒温振荡器中，在120 r·min-1、28 ℃条件下，振荡培养48 h(1个周期)；取振荡培养后水相液体10 mL，重新接种于90 mL无机盐培养液和10 mL润滑油的混合液中，在120 r·min-1、28 ℃条件下，振荡培养48 h；如此重复7个周期。

驯化7个周期结束后，水相液体以划线分离的方法进行琼脂平板分离菌种，再置于30 ℃恒温培养箱内培养，待琼脂平板长出孤立菌落后，将孤立菌落转接于斜面培养基上，置于4 ℃冰箱保存[5，6]。

1.2.2 润滑油降解菌的筛选

将保存在斜面培养基上的菌种接种于100 mL富集培养基中，在120 r·min-1、28 ℃条件下振荡培养24 h，在6000 r·min-1、15 ℃条件下离心分离收集菌体，制备0.5 g·mL-1菌悬液(0.5 g湿菌体悬于1 mL无机盐培养基中)备用。

取100 mL菌悬液与5 mL润滑油混合，在120 r·min-1、28 ℃条件下振荡培养48 h，每24 h用10 mL石油醚萃取混合液的油相，并测定石油醚萃取液中润滑油的含量。测得的润滑油量越少，说明菌种降解润滑油的效果越好，即为润滑油降解菌。

苯胺在自然环境中可被多种微生物降解，故实验中以苯胺作为阳性对照同时进行生物降解实验，观察实验筛选的菌株对阳性有机物的降解能力[7]。

1.2.3 润滑油降解菌的生长特性

选取温度、pH值、NaCl浓度为主要影响因素设计润滑油降解菌培养的正交实验，因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素及水平

按正交表的设计配制培养基，接种相同菌量润滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃条件下振荡培养24 h，在690 nm波长处测定菌悬液的光密度值。菌悬液的浓度与光密度值成正比，光密度值大者可以认为其生长情况较好。

为了解菌株对环境酸碱及盐浓度的耐受能力，调节富集培养基pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，接种相同菌量润滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃条件下振荡培养24 h，在690 nm波长处测定菌悬液的光密度值。

调节富集培养基的NaCl浓度(g·L-1)分别为5、10、15、20、25、26、27、28，接种相同菌量润滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃条件下振荡培养24 h，在690 nm波长处测定菌悬液的光密度值[8，9]。

1.3 分析与检测

润滑油和苯胺含量采用紫外分光光度法测定。扫描润滑油和苯胺在紫外区的透过率，可知实验中使用的润滑油和苯胺均在320 nm波长处有较好的光吸收。根据320 nm波长处吸光度测定润滑油和苯胺的含量。

2 结果与讨论

2.1 润滑油降解菌的驯化、分离和筛选结果

以被石油基污染的土壤为出发菌源、以润滑油为限制性底物，通过增加环境选择压力的方法，驯化、分离、筛选出5株对润滑油具有一定降解能力的菌株，分别标记为RHY-1、RHY-2、RHY-3、RHY-4、RHY-5。菌种在液体培养基中均呈浑浊、悬浮生长，随着培养时间的延长，液体培养基的浑浊程度明显增大。菌种的琼脂平板形成乳白、湿润、凸起的圆形菌落；革兰氏染色可见菌体呈杆状，G-，无芽孢，可初步鉴定为杆菌，其对润滑油的降解能力见表2。

表2 菌株对润滑油的降解能力

由表2可知，5菌株对润滑油均有一定的降解能力，48 h的降解率分别为82.4 %、73.2%、72.6%、60.4%、53.8%，其中菌株RHY-1降解润滑油的能力最强。

由表2还可知，降解48 h时的降解效率明显高于24 h。这可能是因为，当降解时间为24 h时，降解时间较短，菌体未能达到对数生长期。本实验使用的石油基润滑油基本未作处理，且无机盐培养基中除润滑油外无其它碳源，说明降解菌株能够对石油基润滑油进行生物降解，且有较大范围的环境耐受能力。

本实验以被石油基润滑油污染了的土壤为菌源，采用人工增加微生物生活环境中石油基润滑油的方法，极大提高了土壤中微生物的选择压力，在多数微生物细胞被选择掉的同时，幸存的微生物细胞从最初只能耐受石油基润滑油的存在，到最后需要石油基润滑油来维持其生长繁殖，使微生物产生了新性状，即获得能代谢石油基润滑油的菌种。说明加入较高浓度石油基润滑油形成较大的环境选择压力的方法简单有效，是获得新性状菌种的较好方法。

2.2 润滑油降解菌生长特性

选取降解润滑油效果最好的菌株RHY-1进行正交实验，结果与分析见表3。

表3 菌株RHY-1培养的正交实验结果与分析

由表3可知,各因素对菌株RHY-1生长的影响大小依次为：pH值>温度>NaCl浓度；菌株RHY-1在温度为30 ℃、pH值为8.0、NaCl浓度为10 g·L-1的条件下，生长状况较好。

菌株RHY-1在不同pH值和盐浓度下的生长情况见图1和图2。

图1 菌株RHY-1在不同pH值下的生长情况

图2 菌株RHY-1在不同盐浓度下的生长情况

由图1、图2可知，菌株RHY-1可生长的pH值范围为3.0～11.0，可以耐受的NaCl浓度为27 g·L-1，表明该菌株在环境pH值和盐浓度改变较大时，仍能维持正常的生命活动，可以认为实验获得的润滑油降解菌有较强的环境适应能力。

3 结论

(1)以被石油基润滑油污染的土壤为菌源，通过驯化、筛选、分离得到具有较强降解石油基润滑油能力的菌株RHY-1；通过温度、pH值和盐浓度的3因素3水平的正交实验及对环境pH值和盐浓度的耐受实验可知：菌株在温度为30 ℃、pH值为8.0、NaCl浓度为10 g·L-1的条件下，生长状况较好；菌株耐受pH值的范围为3.0～11.0，可耐受的NaCl浓度为27 g·L-1，具有较强的环境适应能力。

(2)采用增加环境选择压力的驯化方法,周期短，限制性底物用量少，获得菌株降解润滑油效果较好，可以认为是一种获得新性状菌种的较好方法，具有一定的实际应用价值。

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