凤眼草抑菌活性成分的研究

宋玉民，王璞玉，卞常鑫，张 琼

(西北师范大学化学化工学院，甘肃 兰州 730070)

凤眼草(Ailanthusaltissima)为苦木科臭椿属药用植物臭椿的果实，又称臭椿子、春铃子，主要分布于浙江、江苏、湖北、河北、河南、天津、北京、甘肃东南等地，以浙江、河北产量较大。臭椿因具有较好的改善和保护自然环境作用，不同部位可入药且活性较好而受到学者的广泛关注。臭椿各个部位的化学成分及其组分的含量略有不同，例如，其干皮和根皮中主要是苦木苦味素类化合物，其次是生物碱类化合物；叶子中主要是黄酮类化合物；果实中主要是脂肪油类，其次是苦木苦味素类化合物[1]。臭椿根或干的皮称为槽白皮，又称椿皮，为《中华人民共和国药典》收载品[2]。迄今为止，人们对臭椿的干皮和根皮做了大量的研究工作，而对其叶与果实研究较少。

臭椿的药理活性多以抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、治疗疟疾等方面为主[3]，具有清热燥湿、涩肠、止血、止带、杀虫等多种功效。早在1966年，美国学者Beuchat等[4]运用酶水解方法从臭椿叶中制备得到叶绿素酸醋，通过比浊法就其对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌的抗菌活性进行评估，结果发现叶绿素酸醋具有较好的活性。1969年，俄国学者从臭椿叶中分离得到一种具有较好抗病毒效果的成分[5]。近年来，我国学者沈逸萍[6]研究发现，凤眼草的水煎煮液对所选的9种菌株均有不同程度的杀菌作用，尤其是对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的作用较强。赵春超等[7～9]从凤眼草的水溶液和95%乙醇提取物中提取出了40多种化合物，其中黄酮类和木脂素类化合物具有抗菌性。

作者在此对凤眼草的95%乙醇提取液进行了抑菌活性研究，为进一步有效利用凤眼草资源提供一定的依据。

1 实验

1.1 材料、试剂、菌株与仪器

干凤眼草，兰州复兴厚药材公司。

95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇，均为分析纯；营养肉汤，杭州微生物试剂有限公司；琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coil)、金黄色葡萄球菌(S.aureus),中国典型培养物菌种保藏中心。

R-1002型旋转蒸发仪，牛津杯(Φ=8 mm)，石家庄伟天科学仪器设备有限公司;TB-85型恒温器,日本岛津公司；LDZX 4OCI型立式自动压力蒸汽灭菌锅，上海中安医疗器械厂；DHG9070A型电热恒温干燥箱，上海益恒实验仪器有限公司；生化培养箱，国华电器；SNCJ LBU型无菌操作台，苏净集团安泰公司；DENSIMAT型细菌电比浊仪，法国生物梅里埃公司。

1.2 提取方法

取干凤眼草3.5 kg用95%乙醇室温浸泡7 d，反复浸泡3次。取上层清液，用旋转蒸发仪蒸馏后得到206.89 g浸膏，浸膏溶解于热水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复萃取3次，得到石油醚提取物112.68 g、氯仿提取物19.95 g、乙酸乙酯提取物13.72 g、正丁醇提取物22.18 g。

1.3 培养基的制备及菌种的培养

培养基的制备：300 mL蒸馏水煮沸，按比例准确加入营养肉汤5.4 g、琼脂粉6.0 g，加热煮沸促其溶解，并补足由于蒸发失去的水分，分装于10 mL的菌种管中，高压蒸汽灭菌后制成斜面培养基；将培养基高压蒸汽灭菌后冷却到60 ℃，倒入已灭菌的培养皿中，水平放置，即得平板培养基。

在培养好的斜面菌种管内加入10 mL无菌水制成菌悬液，用移液枪取200 μL(107cfu·mL-1)菌悬液加入到培养皿中，用无菌刮刀涂布均匀，静置片刻。

1.4 抑菌性能测试

采用滤纸片法[10]测试4种提取物对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coil)的抑菌活性。将4种提取物分别溶解于相应的萃取溶剂中，配制成饱和溶液，将无菌滤纸片(直径d=6 mm)在其中浸渍，分别置于含上述菌的平板培养基上，在37 ℃培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径的大小。

最低抑菌浓度(MIC)的测定：称取10.8 g营养肉汤溶解在600 mL蒸馏水中，煮沸后得到液体培养基；在每支试管中分别加入5 mL营养肉汤液体培养基，灭菌；采用倍比稀释法，向第一支试管中加入5 mL 4 mg·mL-1样品，摇匀后取出5 mL加入第二支试管，混匀后取出5 mL加入第三支试管，依此类推，使每支试管中样品的浓度(mg·mL-1)分别为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625；分别向每支试管中加入200 μL菌液，置于37 ℃摇床培养18 h后测定MIC。

2 结果与讨论

2.1 抑菌圈

根据《消毒技术规范2002》中对抑菌作用的判断：抑菌圈直径>20 mm表示抑菌效果强，抑菌圈直径在10～20 mm表示抑菌效果中等，抑菌圈直径<10 mm表示抑菌效果弱，即抑菌圈直径越大则抑菌活性越高。4种提取物分别对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小见表1。

表1 4种提取物的抑菌圈直径/mm

由表1可知，对枯草芽孢杆菌，石油醚和氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯和正丁醇提取物有中等抑菌性。对大肠杆菌，石油醚和氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯和正丁醇提取物有中等抑菌性。对金黄色葡萄球菌，石油醚提取物无抑菌性，而氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯提取物有中等抑菌性，正丁醇提取物的抑菌性较强。

2.2 最低抑菌浓度(MIC)

乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度测试结果见表2。

表2 2种提取物的最低抑菌浓度/mg·mL-1

由表2可知，等量的2种提取物在相同时间内对3种菌的最低抑菌浓度不同。乙酸乙酯提取物对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度最小，为0.125 mg·mL-1；正丁醇提取物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度均为0.25 mg·mL-1。由此得出，乙酸乙酯提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好，正丁醇提取物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较好。

3 结论

对苦木科臭椿属植物臭椿的果实凤眼草(Ailanthusaltissima)的95%乙醇提取液的抑菌性进行了研究。利用系统溶剂萃取法得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，以其对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌实验，结果显示，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有不同程度的抑菌作用，乙酸乙酯提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好，正丁醇提取物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，为进一步有效利用凤眼草资源提供了依据。

[1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1977：3829-3830.

[2] 姚新生.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社，1988：360-361.

[3] 吕金顺，熊波，郭迈，等.臭椿中新苦木苦素的结构鉴定[J].中山大学学报，2002，41(3)：37-41.

[4] Beuchat L R，Lechowich R V，Schanderl S H，et al.Inhibition of bacterial growth by chlorophyllide[J].Quart Bull，1966，48(3)：411-416.

[5] Chirkina N N，Degtyareva A P.Chemical nature of the antiviral principle of some higher plants[C].Fitontsidy，Mater Soveshch，1969：147-150.

[6] 沈逸萍.凤眼草体外抗菌实验研究[J].时珍国医国药，1999，10(7)：499-502.

[7] 赵春超，邵建华，王金辉，等.凤眼草的化学成分[J].中草药，2006，37(12)：1768-1771.

[8] 赵春超，邵建华，李铣.凤眼草化学成分的研究[J].中国中药杂志，2009，34(17)：2197-2199.

[9] 赵春超.凤眼草和蓬子菜化学成分及生物活性研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2007.

[10] 应建浙，卯晓岚，马启明，等.中国药用真菌图鉴[M].北京:科学出版社，1987：409-449.