厄贝沙坦血浆蛋白结合率测定

李 寅 ，陈凤仪 ， 张国添 ，杨 辉 ， 黄玉玲 ，谢清春 ，钟 鸣

1.广州市番禺区中心医院，广东广州 511400；2.广东药学院药物研究所，广东广州 510006；3.广州汉方现代中药研究开发有限公司，广东广州 510240

厄贝沙坦（Irbesartan）是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体拮抗剂，能特异性地拮抗血管紧张素Ⅱ受体（AT1），通过特异性地拮抗AngⅡ与AT1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用，临床上主要用于高血压的治疗，同时厄贝沙坦在欧盟获准用于一个新的适应证，即治疗有高血压的2型糖尿病患者的肾脏病，是欧盟批准用于预防糖尿病早期及晚期肾脏疾病的第一个抗高血压药。

针对高血压患者血压有明显的昼夜节律改变，本课题组采用双层凝胶骨架片技术制备得到厄贝沙坦缓释片，该缓释片能有效控制厄贝沙坦在体内的释放过程，可以使药物在体内缓慢发挥持续、稳定的降压作用，并能减少由血药浓度突然增高而引起的不良反应的发生，实现夜间平稳降压。根据《药品注册管理办法》及《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》要求，必须对厄贝沙坦缓释片进行药代动力学研究，而“药物与血浆蛋白的结合”是主要研究内容之一。国内外未见厄贝沙坦的血浆蛋白结合率的相关研究报道，而药物的临床疗效和毒性反应与药物的蛋白结合力和结合率密切相关。因此，笔者对厄贝沙坦的血浆蛋白结合率进行研究[1-5]，为申报厄贝沙坦缓释片新药提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Sartorius BA110S电子天平（德国Sartorius公司）；Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪 （Dionex公司）；THZ-82型恒温水浴振荡器（江苏金坛市宏华仪器厂）；XH-C旋涡混合器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；SB 4200DTS型双频超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份超声仪器有限公司）；透析卡（0.5～3.0 ml，美国 Pierce Biotechnology 公司）。

1.2 材料

厄贝沙坦 （深圳迈瑞尔化学技术有限公司，批号：M-1007L08）；厄贝沙坦对照品（深圳迈瑞尔化学技术有限公司，含量99.75%）；氯雷他定（深圳迈瑞尔化学技术有限公司，含量99.83%）。乙腈（色谱纯，依能色谱有限公司）；其他试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。健康人空白血浆由广州市番禺区中心医院提供。

2 方法与结果

2.1 分析方法建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱为 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液（磷酸调pH至2.6）（45∶55）；流速为 1 ml/min；检测波长为 245 nm；柱温为 35℃；进样量为20 μl。在上述色谱条件下，理论板数按厄贝沙坦峰计不低于3000。

2.1.2 溶液配制

2.1.2.1 空白透析液 精密称取磷酸氢二钾14.110 g，磷酸二氢钾2.592 g，氯化钠1.991 g，置于1000 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成pH=7.4的缓冲液，即得。

2.1.2.2 厄贝沙坦储备液 称取105℃干燥至恒重的厄贝沙坦适量，精密称定，加空白透析液制成每1 ml含厄贝沙坦100 μg/ml的储备液，置4℃冰箱中冷藏备用。

2.1.2.3 供标准曲线用厄贝沙坦标准溶液 精密称取105℃干燥至恒重的厄贝沙坦对照品3.12 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为31.20 μg/ml的对照品储备溶液。精密吸取上述对照品储备溶液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ml分别置于 50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。制得浓度为0.31、0.62、1.25、2.50、6.24、12.48、31.20 μg/ml的对照品溶液。

2.1.2.4 供透析用厄贝沙坦溶液 吸取上述厄贝沙坦储备液适量，加空白透析液制成浓度分别为0.2、2.0、20.0 μg/ml的厄贝沙坦溶液，置4℃冰箱中冷藏备用。

2.1.2.5 内标溶液 称取氯雷他定适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含氯雷他定10 μg/ml的对照品溶液，置4℃冰箱中冷藏备用。

2.1.3 透析液样品处理

精密吸取透析内液或透析外液100 μl，加内标溶液10 μl，涡旋混合 2 min，加入乙腈 100 μl，涡旋混合 2 min，离心（16000 r/min）10 min，取上清液，置 50℃水浴，氮气吹干，残渣加流动相 100 μl，涡旋混合 6 min，离心（16000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.1.4 透析液分析方法验证

2.1.4.1 专属性 在上述色谱条件下，厄贝沙坦和内标的保留时间分别为6.03、10.12 min，血浆中其他成分对测定无干扰。

2.1.4.2 标准曲线和线性范围 精密吸取空白血浆或空白透析液200 μl，加供分析方法验证用厄贝沙坦标准溶100 μl，制成厄贝沙坦浓度分别为 0.10、0.21、0.42、0.83、2.08、4.16、10.40 μg/ml的标准样品溶液，按“透析液样品处理”项处理，注入色谱仪，测定峰面积。以厄贝沙坦与内标的面积比为纵坐标（Y），厄贝沙坦浓度为横坐标（C），线性回归。透析内液的线性方程为：Y=0.9245C+0.0256（r=0.9990）线性范围为0.10～10.40 μg/ml，定量下限为 0.10 μg/ml；透析外液的线性方程为：Y=0.8449C+0.0584（r=0.9996）线性范围为0.10～10.40 μg/ml，定量下限为 0.10 μg/ml。

2.1.4.3 精密度 精密吸取空白血浆或空白透析液200 μl，加厄贝沙坦储备液，制成低、中、高三个浓度的溶液（浓度分别为 0.2、2.0、20.0 μg/ml），按“透析液样品处理”项处理，注入色谱仪，测定峰面积。在同一天内连续进样5次及连续3 d测定，分计算日内精密度与日间精密度。结果显示，血浆样品高、中、低三个浓度的平均回收率分别为（99.1±8.2）%、（95.7±7.7）%、（102.4±9.8）%， 日内精密度分别为 5.27%、6.32%、6.88%，日间精密度分别为6.46%、6.73%、7.11%；透析外液样品高、中、低三个浓度的平均回收率分别为（99.7±3.2）%、（98.5±4.3）%、（99.6±4.1）%， 日内精密度分别为 3.22%、3.36%、3.07%，日间精密度分别为3.86%、4.13%、4.40%。

2.1.4.4 提取回收率 取“精密度”项低、中、高三个浓度的标准血浆样品溶液（浓度分别为 0.2、2.0、20.0 μg/ml），每个浓度5份，按“透析液样品处理”项处理，依法测定峰面积（A1）。另取以甲醇稀释的相应浓度对照品溶液，测定峰面积（A2）。按下式计算提取回收率（F）：F=（A1/A2）×100%。 结果显示，高中低 3种浓度的提取回收率分别是 （80.9±7.4）%、（83.2±6.7）%、（78.4±6.6）%。

2.1.4.5 反复冻融稳定性 将“标准曲线和线性范围”项的标准血浆样品作为质控样品，进行冰冻融溶实验。样品置-20℃冰箱中反复3次冻融 （分别于第1、3、7天融溶），室温融溶后，依法测定样品浓度，每个浓度重复5份。结果显示，测定值与理论值的相对误差RSD<10%，表明血浆样品在-20℃下可稳定保存。

2.1.4.6 室温稳定性 取“反复冻融稳定性”项下的融溶样品处理后的进样测定前的分析液，室温下放置2、4、8、12 h，在上述时间点取样，依法测定浓度。结果显示，分析液室温放置12 h不影响含量测定。

2.2 血浆蛋白结合率实验

采用平衡透析法[6]测定厄贝沙坦的血浆蛋白结合率。吸取空白血浆2.0 ml注入处理好的透析卡中，置于200 ml不同浓度厄贝沙坦透析液（浓度分别为 0.2、2.0、20.0 μg/ml，平行3 份）的烧杯中，（37±1）℃平衡透析，分别于 4、8、12、18、24、30 h吸取卡外透析液适量，置试管中加热至沸腾，再滴加5%乙酸检视，应无白色浑浊现象。取出卡内血浆，按“透析液样品处理”项处理，分别测定卡内血浆（C1）及卡外透析液（C2）中厄贝沙坦的浓度。按下式计算不同药物浓度水平的血浆蛋白结合率：血浆蛋白结合率（%）=（C1-C2）/C1×100%。 结果见表 1。

表1 厄贝沙坦血浆蛋白结合率（%）

3 讨论

对厄贝沙坦及辅料在释放介质中的UV吸收特征进行考察，由扫描结果可知，厄贝沙坦溶液在245 nm处有一吸收肩峰，而辅料溶液在该波长处没有吸收，不干扰测定，所以选择245 nm作为检测波长。

实验中先后采用了不同比例的甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-磷酸二氢钾水溶液等作为流动相，结果发现，采用上述流动相，厄贝沙坦色谱峰均有不同程度的拖尾。采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调节pH值至 2.60）（45∶55）为流动相，所得峰形和分离度较好。

厄贝沙坦的血浆蛋白结合率测定结果显示，该药物属于高蛋白结合率的药物（血浆蛋白结合率>90%）。提示，在临床联合用药中，应注意该药与其他高蛋白结合率的药物的使用，有可能会导致一些不良反应。

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