丙型肝炎患者生化变量与细胞因子间的相关性分析

由莉越 ，迟淑萍 ，汪 辰 ，孙 杰 ，周婷婷 ，陈红鸽 ，赵庆国 ，程 云 *

1.解放军第三〇二医院药学部，北京 100039；2.军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）所引起，是危害人类健康的重要疾病之一，其中有很大一部分患者最终发展为肝硬化和肝癌[1]。长期以来，对于丙型肝炎慢性化和肝损伤的机制一直都在探讨之中[2]，在丙型肝炎的诊断和预后效果判断的过程中，肝生化指标的测定结果具有很重要的参考价值。此外，细胞因子重组人干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、 肿瘤坏死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α）、重组人白介素10（interleukin-10，IL-10）都是细胞免疫应答过程中合成分泌的细胞因子，它们同其他细胞因子形成细胞因子网络，对免疫应答进行调节，同时也参与炎症反应，是重要的炎症介质。本研究采用酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）方法检测丙型肝炎患者血清中IFN-γ、IL-10、TNF-α的表达水平，探讨3种细胞因子之间以及其与生化变量之间的相关性，有助于进一步了解HCV引起肝脏损伤的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

慢性HCV感染者的66份外周血均采自解放军第三〇二医院2005年1月～2006年1月的住院确诊的患者。其中，男32 例，女 34例；年龄 7～77 岁，平均（51.5±18.5）岁；27 例有输血史。HCV感染的诊断根据血清抗-HCV和（或）HCV RNA检测阳性。按照2005年第11次全国病毒性肝炎会议修订的诊断标准，将患者分为轻度慢性肝炎33例，中重度慢性肝炎8例，代偿期肝硬变13例，失代偿期肝硬变12例。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞（PBMC）提取后，将分离所得PBMCs用含有100 ml/L的混合人血清的完全RPMI 1640培养，稀释细胞使其终浓度为5×107/ml，以100 μl/孔加入96孔板，37℃、5%CO2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，采用ELISA方法检测上清细胞因子IFN、IL-10、TNF-α的含量。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 以患者血清为模板，提取HCV RNA进行逆转录，然后在AG-600型DNA扩增仪上进行两轮巢式PCR循环，具体的PCR引物以及扩增条件参考我院之前的研究结果[3]，最后利用PE 310全自动遗传分析仪进行序列测定。

1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0统计学软件对各生化变量之间、各细胞因子之间以及各生化变量与各细胞因子之间的相关性进行皮尔森（Pearson）相关性分析。统计结果相关系数≥0.8，高相关性；0.5≤相关系数<0.8，中相关性；0.3≤相关系数<0.5，低相关性；相关系数<0.3，非常低相关性，可以认为不相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标检测结果

本研究共检测生化指标8项，其中丙氨酸氨基转换酶（ALT）、 天门冬酸氨基转换酶 （AST）、ALT/AST、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）七项指标检测了66例患者，CHE指标检测了46例患者，各变量检测结果，计量资料以均数±标准差（）表示。各指标检测结果如下：ALT（81.0±72.4）U/L、AST（65.2±46.5）U/L、ALT/AST（0.95±0.47）、TBIL（12.95±6.31）U/L、DBIL（3.09±2.16）U/L、ALB（44.14±3.03）U/L、GLO（30.24±5.78）U/L、CHE（7108.6±1724.3）U/L。

2.2 细胞因子检测结果

在本研究中检测了3种细胞因子的表达水平，66例患者中有34例检测了细胞因子IFN-γ及IL-10表达水平，同时该34例患者中有33例同时检测了细胞因子TNF-α的表达水平。结果显示IFN-γ表达的平均水平为（76.9±112.3）ng/L，IL-10 表达的平均水平为（1596.4±1313.4）ng/L，TNF-α 平均表达水平为（4253.8±4557.4）ng/L。

2.3 各生化变量与细胞因子间的相关性分析

各生化变量与细胞因子间的相关性较差，除GLO与TNF-α在 0.05置信水平上有较低相关性 （r=-0.287，P=0.046）之外（图1），丙肝患者各血生化指标与各炎症细胞因子之间无显著相关性（P＜0.05）。

图1 GLO-TNF相关性散点图

2.4 各生化指标之间的相关性分析

通过各生化指标之间的相关性分析可以看出各指标之间存在微弱互相关性。其中ALT与AST具有显著相关性（r=0.869，P=0），但是做除法后（ALT/AST）相关性基本被消除，仅存在ALT与ALT/AST的中度相关（r=-0.370，P=0.002）。另外，ALT与GLO在0.05水平正相关，但是相关性非常低 （r=0.283，P=0.021）。对于AST而言，除了与ALT高度相关之外，还与 DBIL（r=0.281，P=0.022）和 GLO（r=0.427，P=0）具有相关性；对于ALT/AST而言，除与ALT中度相关外，还与CHE在0.01 水平呈负相关（r=-0.417，P=0.004），但相关性低；对于TBIL 而言，与 DBIL 在 0.01水平呈正相关（r=0.732，P=0），且为中度相关性；对于ALB而言，与GLO在0.01水平呈负相关（r=-0.461，P=0），且相关性低。

2.5 细胞因子间的相关性分析

细胞因子间的相关性分析显示除IFN-γ与TNF-α之间存在弱相关性（r=0.448，P=0.009）之外（图 2），各细胞因子表达水平之间无明显相关性（P＜0.05）。

3 讨论

图2 IFN-TNF相关性散点图

丙型肝炎是由丙肝病毒所引发，通过输血或血制品、血透析、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。有研究证明，HCV感染者病程进展与诸多因素有关，包括性别、感染HCV的年龄、过度饮酒、脂肪变性、合并感染HBV/HIV、免疫抑制（如器官移植）等[4-5]。在临床诊断其疾病以及疾病发展过程中，肝功能检查是很重要的一项判断指标。Zechini等[6]认为，ALT水平，特别是AST的水平，与肝损伤的程度有关。而有研究[7]则认为，肝损伤程度与临床症状、ALT水平、HCV基因型和病毒载量不相关。Anand等[8]和Rehermann[9]报道在慢性丙型肝炎患者中AST/ALT比值是判断纤维化分期和肝硬化的一个独立指标，当AST/ALT≥1时，高度提示肝硬化的存在。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎时出现白蛋白下降，γ球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。一般情况下，肝损程度与胆红素含量呈正相关。DBIL在TBIL中的比例尚可反映淤胆程度。本研究中，对各生化变量之间进行相关性分析后，除了ALT与AST具有高显著相关性之外，其余的生化变量之间存在弱的相关性，而且在对ALT、AST做除法后（ALT/AST）相关性基本被消除，这就提示在对疾病作判断时不能单纯地看某一指标，必须综合考虑。

以往的研究认为慢性丙型肝炎肝损伤的发病机制是HCV与宿主免疫反应之间相互作用的结果[9]。细胞免疫在HCV感染中具有双重作用，HCV感染机体后，诱导机体产生的Th1类细胞因子，其中就包括IFN-γ和TNF-α，这两种细胞因子同时具有抗病毒和诱发炎症的作用，虽然不足以清除病毒，但仍可诱导机体的肝脏损伤[10]。Yoshioka等[11]研究发现，过量的TNF与暴发型病毒性肝炎和慢性活动性肝炎相关，其本身对感染的肝细胞也有直接的溶解破坏作用。以往的研究也显示，IFN-γ在清除病毒中起重要作用，TNF-α是引起肝脏损伤的重要因素之一[12]。IL-10属于细胞因子中的干扰素家族，最初认为是由Th2淋巴细胞分泌的，能抑制 Th1 细胞合成 IFN-γ、白介素 2（interleukin-2，IL-2），故曾被命名为细胞因子合成抑制因子 （cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF）。IL-10也能抑制炎症因子的合成与释放，de Waal等[13]发现，内源性与外源性IL-10均能在转录水平强烈抑制 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成，从而起到抗炎症的作用。本研究发现，IFN与TNF之间存在弱相关性，而且球蛋白（GLO）与TNF在0.05置信水平上有较低相关性。提示IFN与TNF可以相互诱导表达，以促进HCV的清除，同时，TNF的表达引起肝脏损害的机制可能是通过GLO这个生化指标表现出来。为了更好地分析各生化变量及细胞因子之间的关系，下一步笔者将扩大样品数，以进行更深入细致的分析。

[1]Seeff L.Natural history of viral hepatitis,type C[J].Semin Gastrointest Dis,1995,6(1):20-27.

[2]Alberti A,Benvegnu L.Management of hepatitis C[J].J Hepatol,2003,38(suppl):S104-S118.

[3]赵军.北京地区46例II型/1b型HCV高变区1的序列变异研究[J].中华肝脏病杂志,1999,7(2):88-90.

[4]Leone N,Rizzetto M.Natural history of hepatitis C virus infection:from chronic hepatitis to cirrhosis,to hepatocellular carcinoma [J].Minerva Gastroenterol Dietol,2005,51(1):31-46.

[5]Orellana NI,Poniachik TJ,Smok SG,et al.Factors associated with the severity of liver damage in chronic hepatitis C[J].Rev Med Chil,2005,133(11):1311-1316.

[6]Zechini B,Pasquazzi C,Aceti A.Correlation of serum aminotransferases with HCV RNA levels and histological findings in patients with chronic hepatitis C:the role of serum aspartate transaminase in the evaluation of disease progression[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2004,16(9):891-896.

[7]谭龙益,张莉,王皓,等.HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系[J].第二军医大学学报,2004,25(12):1307-1309.

[8]Anand BS,Velez M.Assessment of correlation between serum titers of hepatitis C virus and severity of liver disease[J].World J Gastroenterol,2004,10(16):2409-2411.

[9]Rehermann B.Interaction between the hepatitis C virus and the immune system[J].Semin Liver Dis,2000,20(2):127-141.

[10]Sun J,Li K,Shata MT,et al.The immunologic basis for hepatitis C infection[J].Currop in Gastroenterol,2004,20(6):598-602.

[11]Yoshioka K,Kakumu S,Arao M,et al.Immunohistochemical studies of intrahepatic tumor necrosis factor alpha in chronic liver disease [J].J Chin Pathol,1990,43(4):298-302.

[12]李跃旗,徐鹏辉,苏海滨,等.慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析[J].第四军医大学学报,2007,28(9):843-845.

[13]De Waal MR,Abrams J,Bennett B.Interleukin 10(IL-10)inhibits cytokine synthesis by human monocytes:an autoregulatory role of IL-10 ptoduced by monocytes[J].J Exp Med,1991,174(5):1209-1220.