复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查方法的研究

王银娟，陆 崟，岩林萍，王曙东

南京军区南京总医院制剂科，江苏 南京 210002

磷酸盐为人体每天必需的无机盐，能调节维生素D的代谢，维持钙的内环境稳定，我院根据临床需要率先开发研制出含有磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的复方磷酸盐注射液，作为成人静脉营养治疗过程中的磷补充剂，用以满足人体每天对磷的代谢需求。目前，国内尚未见复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查方法的报道。为了更安全有效地控制其质量，本文依据《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法[1]，对复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查法进行了方法学研究，以期能为同类制剂质量标准的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZH-2自动旋涡混合器 （天津药典标准仪器厂）；BET细菌内毒素检查仪（天津药典标准仪器厂）。细菌内毒素检查用器具均经250℃干烤1 h以上去除热原，放冷使用。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品 （CSE）（中国药品生物制品检定所，批号：150601-200963，规格：120 EU/支）；鲎试剂（TAL，λ=0.5 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司，批号：0904172、0912181；湛江博康海洋生物有限公司，批号：0903113、0912260）；细菌内毒素检查用水 （WBET，湛江安度斯生物有限公司，批号：0908280，规格：50 ml/支）。复方磷酸盐注射液 （自制，批号：100204、100523、100613，规格：10 ml/支，家兔热原检查合格）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定[2]

根据公式：细菌内毒素限值（L）=K/M。依据药品使用说明书，成人每次用量为1支（10 ml），将本品加入5%或10%葡萄糖注射液500 ml中进行输注，在2 h内缓慢输注完毕。公式中，M为人用每公斤体重每小时最大剂量，中国人均体重按 60 kg 计， 则 M=10 ml/（60 kg·2 h）=0.0833 ml/（kg·h），K为人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，静脉给药时 K=5.0 EU/（kg·h）， 则 L=5.0 EU/（kg·h）/0.0833 ml/（kg·h）=60 EU/ml。考虑到临床联合用药的安全性和细菌内毒素的累加性[3-4]，在上述计算限值基础上将限值要求提高10倍，由此确定复方磷酸盐注射液的细菌内毒素限值为6 EU/ml。

2.2 鲎试剂灵敏度（λ）复核

按照《中国药典》2010年版二部鲎试剂“灵敏度复核”项下对2个厂家的TAL进行复核，λc在0.5λ～2.0λ之间，均符合规定。其中阳性指形成凝胶且倒置不变形滑落，阴性指指未形成凝胶或形成凝胶但倒置后变形滑落。鲎试剂灵敏度复核试验结果，见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.3 供试品的干扰试验

2.3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确定 按公式MVD=CL/λ，式中L为供试品的细菌内毒素限值，λ为测试用鲎试剂的灵敏度标示值，C表示供试品的浓度，目前市售鲎试剂λ通常在 0.50～0.03 EU/ml之间，对应的有效稀释倍数为 12、24、48、100、200。

2.3.2 干扰预试验 取复方磷酸盐注射液原液，并用WBET分别将其稀释 6、12、24、48、100、200 倍制成溶液， 作为供试品溶液（NPC）系列。另制备具有相同浓度的供试液，且每一浓度的供试液中均含2 λ内毒素浓度（1 EU/ml）的供试液，作为供试品阳性（PPC）系列。取2个厂家的TAL（λ为0.5 EU/ml）分别与上述NPC、PPC系列反应，每一浓度重复2次，并按常规设阳性管（PC）和阴性管（NC）对照。预试验结果表明，复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应不存在干扰现象。见表2。

表2 复方磷酸盐注射液的干扰预试验结果

2.3.3 正式干扰试验 为了最终确认复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应是否存在干扰，将供试品原液和WBET分别将CSE制成含内毒素浓度为1.000、0.500、0.250、0.125EU/ml的系列溶液（分别为PPC系列和NPC系列），与2个厂家共4个批号的TAL（λ均为0.5 EU/ml）反应，每一浓度平行4管，并设阴性对照（NC）。正式干扰试验结果见表3。

表3 复方磷酸盐注射液的干扰试验结果

结果表明，2个厂家4个批号的TAL结果Es均在0.5λ～2.0λ 范围内，Et均在 0.5Es～2.0Es之间，符合《中国药典》2010年版（二部）附录细菌内毒素检查法中的规定。由此确定复方磷酸盐注射液原液为细菌内毒素检查中无干扰的最小有效稀释倍数。

2.4 复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查

取3批经热原检查合格的复方磷酸盐注射液原液，使用灵敏度为0.5 EU/ml的2个不同厂家的鲎试剂，按《中华人民共和国药典》2010年版（二部）附录XI E规定的细菌内毒素凝胶限量检查法对样品分别进行检测。复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查结果，见表4。

表4 细菌内毒素检查结果

综上所述，3批复方磷酸盐注射液的细菌内毒素含量均小于6 EU/ml。结果提示，复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂与细菌内毒素凝集反应无干扰作用，可适用于细菌内毒素的检查。

3 讨论

细菌内毒素限值标准要求定太高可能会使很多批次不能通过检查，从而造成浪费；标准要求定太低则不能保证药品质量，危及临床用药安全，所以细菌内毒素限值的确定需结合临床用药实际，要具合理性。

对复方磷酸盐注射液样品进行细菌内毒素检查时，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验，从而减少污染环节，使操作更为便捷、经济。如果供试品溶液在以不超过MVD的某个稀释倍数稀释，检测结果为阳性时，可对供试品溶液进行进一步稀释但不能超过MVD，再重新进行试验。

复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应无干扰作用，可采用《中国药典》2010年版二部细菌内毒素检查法，用灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂对复方磷酸盐注射液进行检测。结果表明，本法操作简单，灵敏快捷、实用性强，并经我院多年临床使用验证，该方法安全可靠，可用于复方磷酸盐注射液的细菌内毒素检查。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录XI85-88.

[2]王海燕.从细菌内毒素累加的性质看全面质量管理[J].中国现代医生,2007,45(13):102-103.

[3]李楚云,陈健红,詹云丽.开展药学服务控制输液热源反应[J].中国现代药物应用,2010,4(6):218-219.

[4]郑霞,赵毓梅,刘春.盐酸卡尼地平葡萄糖注射液细菌内毒素检查[J].中国药房,2008,19(1):56-57.