正交实验法研究山楂提取物对α-淀粉酶活性的影响

陈木洲 ，邹 萍 ，彭国平 ，杨 华

1.广东众生药业股份有限公司，广东 东莞 523325；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128

山楂是一种能够消食导滞的中药材，对消肉食积滞作用更好，除含有大量有机酸外，还有60余种黄酮类化合物：芹菜素、山奈酚类、木犀草素、槲皮素类及二氢黄酮类等[1-3]，α-淀粉酶能促进多糖物质的消化吸收，二者配合能够获得效果更好的消食效果[4]。本文旨在研究山楂提取物对消食药物α-淀粉酶的活性影响，以期获得一个合适的山楂提取物添加量和山楂提取物与α-淀粉酶复合消食制剂配制条件。

1 仪器与材料

山楂 （市售），α-淀粉酶 （湖南尤特尔生化有限公司提供），60%乙醇溶液 （V/V）， 蒸馏水，3，5-二硝基水杨酸试剂（取3，5-二硝基水杨酸1.0 g，溶于20 ml的1 mol/L氢氧化钠中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠），麦芽糖，淀粉，pH梯度缓冲溶液 （用0.2 mol/L Na2HPO4与0.1 mol/L柠檬酸按比例配制）。

2 方法与结果

2.1 山楂提取物的提取

2.1.1 麦芽糖标准曲线的制作 应用DNS法[5-6]以光密度值OD为纵坐标（Y），麦芽糖含量为横坐（X）标绘制标准曲线。结果显示，麦芽糖标准曲线为Y=7.6641X-0.0573，r=0.9935，线性关系良好。

2.1.2 山楂提取物的提取 准确称取2 g山楂粗粉，用12倍量60%的乙醇在90℃下各回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩干燥，得到山楂提取物。

2.2 山楂提取物对α-淀粉酶促反应影响的单因素试验

2.2.1 山楂提取物浓度对α-淀粉酶活性的影响 将山楂提取物用10倍稀释法稀释成浓度依次为0.1000、0.0100、0.0010、0.0001、0.00001、0 mg/ml溶液，在试管中按表1条件依次加入试剂，并加入不同稀释梯度的山楂提取物0.2 ml进行反应，同时以0.2 ml蒸馏水取代山楂提取物在相同条件下进行酶促反应作为空白对照，每个反应重复3次。结果显示，在山楂提取物浓度为 0.1000、0.0100、0.0010、0.0001、0.00001、0 mg/ml时 α-淀粉酶活性分别为 （608.43±2.70）、（514.33±3.44）、（489.37±2.38）、（458.75±4.51）、（439.27±3.24）、（437.36±3.68） mg/（g·5 min），表明加入的山楂提取物对 α-淀粉酶活力有明显的促进作用，且随着山楂提取物浓度的降低，促进作用减弱，山楂提取物对α-淀粉酶活性最适浓度为0.1 mg/ml。

2.2.2 温度对山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影响 按照表1的条件，加入浓度为0.1 mg/ml的山楂提取物，pH为6.0，酶促反应温度分别控制为 25、30、40、50、60℃，考察山楂提取物存在下不同温度条件对α-淀粉酶酶促反应的影响，每个温度条件重复3次，结果取均值。结果显示，在以上温度下α-淀粉酶活性分别为 （582.14±6.31）、（603.56±4.58）、（678.87±7.49）、（545.43±8.55）、（610.33±5.56） mg/（g·5 min），结果表明在山楂提取物存在下α-淀粉酶活性最高的温度为40℃。

表1 酶促反应条件表（ml）

2.2.3 pH大小对山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影响 按照表1的条件，加入浓度为0.1 mg/ml的山楂提取物，反应温度为 60℃，分别用 pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的缓冲液配制酶液和山楂提取物，考察山楂提取物存在下不同pH条件对α-淀粉酶酶促反应的影响，每个pH条件重复3次，结果取均值。结果显示，在以上pH条件下α-淀粉酶活性分别为（175.62±4.24）、（581.33±3.75）、（620.12±1.36）、（539.57±7.61）、（675.72±2.82） mg/（g·5 min），表明 α-淀粉酶作用的最适 pH 为 7.0。

2.3 山楂提取物对α-淀粉酶促反应影响的正交试验

根据单因素试验结果，按照表2设计正交实验因素水平表，摸索最佳酶促条件。正交实验结果，见表3。

表2 正交试验因素水平设计

由表3可知，影响酶活的因素重要性依次为pH＞山楂提取物浓度＞温度。促进α-淀粉酶活力的最佳组合为A2B1C1，即pH为6.8，温度为40℃，加入稀释5倍的山楂提取物，即相当于加入生山楂量∶α-淀粉酶=88.900∶0.001，α-淀粉酶活力最高。

按照A2B1C1条件进行验证试验，平行3次，酶活力分别为687.521、685.241、688.275 mg/（g·5 min），平均酶活力 为687.021 mg/（g·5 min），证明酶促反应实验的重复性好，酶活力高。

3 讨论

由于被动大量摄入谷物类、高蛋白类食物所致的食物结构不合理现象在婴幼儿中显得很突出，导致消化不良现象经常发生，由此引发了一系列的消化道疾病，因此，如果以消肉食的山楂和消化谷物类的α-淀粉酶制备成复合消化剂，可以同时解决蛋白质和淀粉类食物的消化不良问题。

作为生物催化剂的α-淀粉酶的活性受到很多因素的影响，其中最大的影响是pH值。添加了山楂提取物后，对其合适添加量的确定及温度也很重要。正交试验优化了这三个因素的影响。Ga2+对α-淀粉酶活性具有促进作用，本实验中对Ga2+浓度进行了试验，发现Ga2+浓度的变化不是主导因素。通过合理的工艺设计，可以将本实验中优化的配方与条件进行规模化生产。

表3 正交试验结果直观分析表

本实验得到的最优条件是将山楂用12倍量60%的乙醇在90℃下回流提取2次，每次1 h，将滤液减压浓缩干燥既得山楂提取物；山楂提取物与α-淀粉酶的复合制剂配方为pH为6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解酶，温度不超过40℃，山楂提取物添加量为20%浓度，此配方可以制备成服用方便的口服液。

[1]董英杰,张乃先,张明磊,等.大果山楂叶黄酮成分研究[J].沈阳药科大学学报,1996,13(1):31-33.

[2]张培成,徐绥绪.山楂叶化学成分研究[J].药学学报,2001,36(10):754-757.

[3]英锡相,李绍维,林延会,等.山楂叶植物学及化学成分研究近况[J].辽宁中医学院学报,2001,3(2):98-99.

[4]王慧超,陈今朝,韩宗先.α-淀粉酶的研究与应用[J].重庆工商大学学报:自然科学版,2010,27(4):368-372.

[5]田芳年,马连荣,莫肖云,等.DNS法测定红枣总糖含量[J].化工技术与开发,2009,38(9):45-47.

[6]宋阳,王亚琼,赵丽恋,等.基于淀粉酶活性检测的麦芽质量评价方法[J].药学进展,2010,34(9):411-417.