赤藓糖醇产生菌诱变育种新途径

贾丰彬，陈建华

(中国药科大学分子生物学教研室，江苏 南京 210009)

赤藓糖醇(Erythritol)化学名称为1，2，3，4-丁四醇，广泛存在于水果、发酵食品中，甜度为蔗糖的70%～80%。能被小肠快速吸收，但90%没有进行代谢而排出体外，是在自然界中发现的相对分子质量最小的糖醇，不仅拥有糖醇类产品所有的卓越功能，如防龋齿、适于糖尿病患者食用，还独具热量极低(≤1.66 kJ·g-1)和耐受量高(无副作用)的特性。赤藓糖醇具有良好的食品加工适应性和生理保健功能，作为一种新型功能性保健食品原料被广泛用于食品、医药、化妆品及化工等领域[1]。

赤藓糖醇工业上主要是用耐高渗酵母或其它主产赤藓糖醇的微生物发酵生产，选择适宜的育种方法、选育赤藓糖醇优产菌株是生产的关键。据文献报道[2]，1950年Binkey和Wolform首次提出酵母菌可以产生赤藓糖醇。其后国内外学者就产赤藓糖醇菌株筛选进行了大量研究。范光先等[3]筛选出一株单产赤藓糖醇的球状酵母OS-194，Marimuthu等[4]从污泥中筛选得到一株耐高渗酵母P.tsukubaensisKN75，吴燕等[5]筛选得到一株圆酵母Torulasp.，Lin等[6]从蜂蜜中筛选出一株菌Moniliellasp.440，以上菌株均是通过葡萄糖高渗法从自然界直接分离得到的。

作者通过对产甘油耐高渗酵母进行紫外诱变处理产赤藓糖醇，为赤藓糖醇产生菌的筛选及产量提高提供了一条新的途径。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

菌种：从自然界分离的产甘油耐高渗酵母CF4。

葡萄糖、浓硫酸，南京化学试剂有限公司；酵母膏，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，汕头市西陇化工厂有限公司。以上试剂均为分析纯。

722型可见分光光度计，上海天普仪器有限公司；1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖20%，酵母膏1%，琼脂2%，pH值5～6。

发酵培养基：葡萄糖 20%，酵母膏1%，尿素0.5%，pH值5～6。

种子培养基：葡萄糖20%，酵母膏1%，pH值5～6。

1.3 方法

1.3.1 菌株CF4生长曲线的测定

自新鲜的CF4斜面培养基挑取一环接种到液体种子培养基中，30℃、200 r·min-1培养，每隔2 h取样，离心，弃上清，收集菌体，将菌体重悬于蒸馏水中，反复2次，测定菌体密度OD600，以蒸馏水作为空白对照，绘制菌株CF4的生长曲线。

1.3.2 菌悬液的制备[7]

自新鲜的CF4斜面培养基挑取一环接种到盛有30 mL种子培养基的250 mL三角烧瓶中，30℃、200 r·min-1培养10～18 h。取5 mL种子液，3000 r·min-1离心10 min，弃上清，菌体用生理盐水洗涤2次，重悬于5 mL生理盐水中制成菌悬液。

1.3.3 紫外诱变处理

开启20 W紫外灯，预热30 min，使波长稳定。将4 mL出发菌株的菌悬液分散于灭菌的培养皿中，在距紫外灯25 cm处，照射60 s、90 s、180 s、270 s、360 s，处理后的菌悬液被稀释至1×10-6。吸取0.2 mL稀释菌悬液涂布于含有培养基的平皿中，30℃培养箱中避光培养。

1.3.4 突变菌株的筛选

待单菌落长出后，挑取菌落大、厚实的菌株分别接种到斜面培养基中，30℃培养48 h后，接种于30 mL/250 mL的发酵培养基中，30℃、200 r·min-1培养3 d，用薄层层析和高效液相色谱定性，筛选出产赤藓糖醇的菌株，然后按接种量8%移种于50 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、200 r·min-1培养5 d，用高效液相色谱测定赤藓糖醇的产量，确定优势菌株。

1.4 分析测试

1.4.1 发酵液中赤藓糖醇和葡萄糖定性分析(薄层层析法)[8]

用毛细管分别将标准品和样品在制好的薄层板上点样，放在正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5的展开剂中上行4～5 h后显色，显色剂为高碘酸钠-联苯胺溶剂，将薄层板从展开缸中取出，烘干，浸入高碘酸钠溶液中，取出后再浸入联苯胺溶液中，烘干，观察薄层板上变化。

1.4.2 发酵液中赤藓糖醇含量测定(高效液相色谱法)[9]

色谱条件：色谱柱为Lichrospher 5-NH2(4.6 mm× 250 mm)；柱温30℃；流动相为乙腈-水(80∶10，体积比)；流速1.0 mL·min-1；示差折光检测器，检测器温度为35℃。

测定方法：精密称取赤藓糖醇对照品0.5 g定容于10 mL容量瓶中，用流动相制成50.00 g·L-1的储备液，再将其稀释为0.50 g·L-1、1.00 g·L-1、2.00 g·L-1、4.00 g·L-1、6.00 g·L-1、8.00 g·L-1和10.00 g·L-1的标准溶液。每一浓度分别进样10 μL，测定3次，取峰面积平均值，绘制标准曲线。

1.4.3 紫外诱变处理后致死率的测定[10]

采用平板计数法测定致死率：将紫外诱变处理前、后的菌液分别用生理盐水稀释至1×10-6，各吸取0.2 mL涂布于含有培养基的平皿中，以未处理的菌液作对照，30℃培养48 h，单菌落计数，计算致死率。

2 结果与讨论

2.1 发酵液中赤藓糖醇和葡萄糖定性分析结果

2.1.1 薄层层析分析(图1)

1.甘油标准品 2.混合标准品，自上而下为赤藓糖醇、葡萄糖 3～6.CF4发酵液 7.UV3-CF4-5 8.UV4-CF4-3 9.混合标准品，自上而下分别为甘油、赤藓糖醇 10.UV3-CF4-1 11.UV3-CF4-3

对发酵液进行薄层层析分析，薄层板上出现了白色斑点。由图1可知，菌株CF4只产生甘油，经紫外诱变后，有赤藓糖醇产生。

2.1.2 标准品与菌株CF4诱变前后发酵液的高效液相色谱图(图2、图3)

图2 甘油标准品(A)和菌株CF4诱变前发酵液(B)的高效液相色谱图

图3 赤藓糖醇标准品(C)和诱变菌株UV3-CF4-5发酵液(D)的高效液相色谱图

由图2可知，甘油的保留时间为7.10 min左右，菌株CF4诱变前只产甘油，与薄层层析结果一致。

由图3可知，赤藓糖醇保留时间为8.77 min左右，紫外诱变菌株UV3-CF4-5只产赤藓糖醇，与薄层层析结果一致。

2.2 菌株CF4的生长曲线(图4)

图4 菌株CF4的生长曲线

由图4可以看出，培养2～8 h期间菌体数量变化不明显，为延滞期；10 h后菌体数量迅速增加，进入生长期；20 h后菌体数量趋于稳定，即进入稳定期，可见该菌株的对数生长期在10～20 h之间。因此，选取培养时间为16 h的菌株进行紫外诱变。

2.3 标准曲线

以赤藓糖醇浓度(g·L-1)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，见图5。拟合得回归方程y=75791x+18334，R2=0.999，赤藓糖醇浓度范围为0.5～10 g·L-1时，线性相关较好。

图5 赤藓糖醇浓度与峰面积的关系曲线

2.4 紫外诱变时间的确定(图6)

图6 紫外诱变时间对致死率的影响

由图6可知，紫外诱变270 s时，致死率达85%以上，因此，确定紫外诱变时间为270 s。

2.5 菌株紫外诱变结果

菌株CF4经过紫外诱变处理，在平皿上长出较大、厚实的单菌落共36株，其中获得了6株产赤藓糖醇菌株，命名为UV4-CF4-3、UV3-CF4-1、UV3-CF4-5、UV3-CF4-4、UV3-CF4-3、UV3-CF4-6，挑取接种到斜面上，再分别接种到发酵培养基中，培养5 d，测定赤藓糖醇的产量，结果见表1。

表1 菌株CF4紫外诱变结果

由表1可以看出，菌株UV3-CF4-5赤藓糖醇产量最高，为25.68 g·L-1，因而选择UV3-CF4-5作为优势菌株进行后续实验。

2.6 菌株稳定性实验

将UV3-CF4-5进行传代培养，测定赤藓糖醇的产量，结果见表2。

表2 UV3-CF4-5的遗传稳定性

由表2可知，UV3-CF4-5经过5次传代，赤藓糖醇产量比较稳定，说明该菌株产赤藓糖醇有较好的稳定性。

2.7 讨论

目前，赤藓糖醇产生菌主要是通过耐高渗法从自然界分离，而自然界筛选出的耐高渗菌株大多数产甘油，单产赤藓糖醇菌株较少并很难达到工业化生产的要求，这样极大地限制了高产赤藓糖醇菌株的分离。

在酵母菌代谢过程中，葡萄糖通过糖酵解和磷酸戊糖途径产生大量的还原能，从而导致多种多元醇的生成。赤藓糖醇主要是通过磷酸戊糖途径合成的，葡萄糖通过磷酸戊糖途径在4-磷酸赤藓糖脱氢酶作用下生成4-磷酸赤藓糖，4-磷酸赤藓糖在赤藓糖-4-磷酸激酶作用下生成赤藓糖，然后在赤藓糖还原酶作用下生成赤藓糖醇。甘油是在糖酵解过程中产生的，葡萄糖通过糖酵解，在一系列酶的作用下生成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛氧化生成3-磷酸甘油酸的过程中产生甘油[11]。本实验对甘油产生菌进行紫外诱变，可能阻断了糖酵解的过程，而使葡萄糖降解主要通过磷酸戊糖途径进行，生成赤藓糖醇，具体阻断机制需要进一步研究证明。

3 结论

(1)通过对产甘油菌株CF4进行紫外诱变处理，获得了6株产赤藓糖醇的菌株，其中菌株UV3-CF4-5产量最高，为25.68 g·L-1，效果比较显著，为产赤藓糖醇菌株的筛选提供了一条新的途径。

(2)研究了菌株UV3-CF4-5的遗传稳定性，结果表明，经过多次传代，菌株UV3-CF4-5产赤藓糖醇的能力没有改变，表明其是稳定的变异株。

[1] Kwang J L，Lim J Y.Optimized condition for high erythritol production byPenicilliumsp.KJ-UV29，mutant ofPenicillumsp.KJ81[J].Biotechnology，2003，8(3)：173-178.

[2] Yoshihiko H，Keisuke I，Satosh I，et al.High-level production of erythritol by strain 618A-01 isolated from pollen[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，87(5)：630-635.

[3] 范光先，张海平，诸葛健.耐高渗酵母产赤藓糖醇的影响因素[J].无锡轻工大学学报，2001，20(2)：133-136.

[4] Marimuthu J，Kyoung M L，Kim J S.Isolation of a novel high erythritol-producingPseudozymatsukubaensisand scale-up of erythritol fermentation to industrial level[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，83(1)：225-231.

[5] 吴燕，吕惠敏，施大林，等.新型甜味剂——赤藓糖醇产生菌的筛选[J].生物技术，2000，10(13)：17-19.

[6] Lin Shie-Jea，Wen Chiou-Yen，Wang Pei-Ming.High-level production of erythritol by mutants of osmophilicMoniliellasp.[J].Process Biochemistry，2010，3(5)：2-3.

[7] 徐虹，周基化，欧阳平凯.赤藓糖醇产生菌的筛选[J].南京化工大学学报，1995，17(Z)：14-17.

[8] 权静，吴永宏.高效液相色谱法测定发酵液中的赤藓糖醇[J].安徽农业科学，2008，36(30)：13005，13010.

[9] 刘凤珠，张鑫.产赤藓糖醇菌种的诱变育种[J].生物技术，2005，15(4)：22-23.

[10] 沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000：231-233.

[11] Moon H J，Marimuthu J，Kim I W，et al.Biotechnological production of erythritol and its applications[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，86(2)：1017-1025.