高效液相色谱法分析胞内S-腺苷-L-甲硫氨酸含量及其合成酶活性的优化研究

姚高峰，秦秀林，储 炬，钱江潮

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，简称SAM)是一种重要的中间代谢物，广泛存在于微生物、动物、植物体内，可作为甲基、亚甲基、氨基、核糖、氨丙基的供体，参与体内的各种生化反应[1～3]。作为一种具有重要生理活性的物质，SAM在治疗肝炎、肝功能紊乱、关节炎、抑郁症、心血管等疾病以及抗衰老、防癌[4]等方面发挥着重要作用[5，6]，市场需求日益增大。

生物反应器工程国家重点实验室通过在重组毕赤酵母(Pichiapastoris)中高效表达SAM合成酶，获得了能大量积累SAM的重组菌G/DS16[7]。但利用HPLC方法定量分析胞内SAM含量及SAM合成酶活性时存在保留时间长或峰宽、分离效果不佳的问题[8～10]。

针对胞内SAM抽提液及SAM合成酶测定体系中SAM的分离，作者对HPLC方法的流动相和洗脱程序进行优化，以建立一种分离效果好、精确度高、重复性好、保留时间适中的SAM定量分析方法，用于测定胞内SAM含量与SAM合成酶活性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

SAM标准品，Sigma公司；ATP、L-Met，上海生工生物工程有限公司；高氯酸、甲酸铵、甲酸均为分析纯；水为双蒸水。

Agilent HP1100型高效液相色谱仪，Thermo Scientific型冷冻离心机，QT-1型漩涡混合器，电子天平，恒温水浴锅，0.22 μm水相滤头等。

1.2 菌种

菌种G/DS16，自行构建保藏[7]。G/DS16为基因工程改造菌，甲醇诱导并补加甲硫氨酸后胞内SAM合成酶活性增大，SAM含量较高。

1.3 色谱条件

Thermo-BioBasic SCX色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲酸铵溶液(pH值4.0)，流速1 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

1.4 流动相的配制

准确称取31.5 g甲酸铵溶于水中，定容至1000 mL，配制成浓度为0.5 mol·L-1的甲酸铵溶液，用甲酸调pH值4.0左右。取0.5 mol·L-1甲酸铵溶液适量，稀释至终浓度为5 mmol·L-1，用甲酸调pH值4.0左右。流动相现配现用，0.22 μm水相滤头过滤。

1.5 标准溶液的配制

准确称取SAM标准品25 mg，加水溶解，定容，配制成浓度为1.0 g·L-1的标准品储备液。取适量标准品储备液加水稀释，得浓度分别为0.5 g·L-1、0.35 g·L-1、0.25 g·L-1、0.15 g·L-1、0.05 g·L-1的标准溶液。进样前用0.22 μm水相滤头过滤。

1.6 样品制备

1.6.1 胞内SAM抽提样品

取G/DS16发酵液1 mL，12 000 r·min-1离心2 min，去上清，加入1 mL10%三氯乙酸(TCA)重悬，于4 ℃静置抽提2 h，离心后取上清液，用0.22 μm水相滤头过滤，待测。

1.6.2 SAM合成酶活性测定样品

发酵过程中SAM合成酶的酶活水平是通过测定体外酶促反应液的SAM含量来监控的。取1 mL G/DS16发酵液，离心去上清，加1 mL缓冲溶液和等体积的酸洗玻璃珠，按冰水浴30 s、振荡破碎30 s交替进行8次，12 000 r·min-1、4 ℃离心7 min以上，上清即为粗酶液。SAM合成酶活性测定反应体系见表1。

表1 SAM合成酶活性测定反应体系

反应体系在37 ℃反应1 h，加500 μL 20%高氯酸，4 ℃放置0.5 h以上终止反应，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min以上，取上清，用0.22 μm水相滤头过滤，待测。以不加粗酶液、ATP或L-Met的反应体系作为对照。

2 结果与讨论

2.1 流动相与洗脱程序的优化

首先以普遍使用的0.5 mol·L-1(pH值4.0)甲酸铵作为流动相进行HPLC测定，结果见图1。

★—SAM —杂质(a)SAM标准品 (b)SAM合成酶活性测定对照组 (c)SAM合成酶活性测定样品 (d)胞内SAM抽提样品

由图1可知，对于SAM合成酶活性测定反应体系，0.5 mol·L-1甲酸铵溶液作为流动相的分离效果不佳。SAM合成酶活性测定对照组分离时在SAM峰相应处出现一个杂质峰(图1b)，这可能是由于其中含有ATP、L-Met以及反应生成的一些杂质，这些物质的保留时间与SAM相同，造成了对SAM测定的干扰。而检测SAM合成酶活性测定样品时，杂质峰与SAM峰重叠(图1c)，严重影响了测定结果的准确性。而且，采用0.5 mol·L-1甲酸铵为流动相，5 min之内可完成洗脱过程，SAM保留时间过短，即使在胞内抽提样品中，也存在保留时间相近的其它物质(图1d)，严重影响了分离效果。

为了获得较好的分离效果，针对流动相和洗脱程序进行优化。通过改变流动相中的甲酸铵浓度来调节保留时间，优化的洗脱程序如下：以5 mmol·L-1的甲酸铵洗脱5 min，去除大量杂质；然后提高甲酸铵的浓度(0.5 mol·L-1甲酸铵∶5 mmol·L-1甲酸铵=9∶1)洗脱4 min；再用0.5 mol·L-1的甲酸铵洗脱3 min，将SAM洗脱；最后用5 mmol·L-1的甲酸铵重新平衡柱子。整个洗脱过程中，流动相的pH值为4.0，流速为1 mL·min-1。

在优化的流动相和洗脱程序下进行HPLC测定，结果见图2。

★—SAM —杂质(a)SAM标准品 (b)SAM合成酶活性测定对照组 (c)SAM合成酶活性测定样品 (d)胞内SAM抽提样品

由图2可知，SAM标准品保留时间为10.1 min左右，峰形较好(图2a)；SAM合成酶活性测定对照组样品中的杂质与SAM得到了很好的分离(图2b)；SAM合成酶活性测定样品以及胞内SAM抽提样品中SAM组分都得到了有效分离，峰宽、峰形较理想，没有杂质峰的干扰(图2c、d)。这说明适合的SAM保留时间排除了保留时间短可能造成的溶剂峰干扰，且相对于反相C18柱法较长的保留时间[11]，该方法的检测效率明显提高。

2.2 SAM的标准曲线

取浓度为0.05～0.5 g·L-1的SAM标准溶液，采用优化的流动相和洗脱程序进行HPLC分析，以峰面积(y)对SAM浓度(x)绘制标准曲线，见图3。

图3 SAM的标准曲线

由图3可知，在0.05～0.5 g·L-1浓度范围内，SAM的浓度和峰面积线性关系良好，标准曲线方程为y=25.5+7098.0x，R2为0.99996。

2.3 精密度

取10 μL 250 mg·L-1的SAM标准溶液进样，平行测定5次，结果见表2。

表2 精密度实验结果(n=5)

由表2可知，相对标准偏差为0.45%，表明该方法精密度良好。

2.4 重复性

分别取同一SAM合成酶活性测定样品和胞内SAM抽提样品10 μL进样，平行测定5次，结果见表3。

表3 重复性实验结果(n=5)

由表3可知，相对标准偏差分别为0.49%和0.59%，表明该方法重复性良好。

2.5 回收率

分别取已知浓度SAM合成酶活性测定样品和胞内SAM抽提样品各6份，3份一组，各添加2个不同浓度(100 mg·L-1、300 mg·L-1)的SAM标准品，按优化色谱条件进样，结果见表4。

表4 加样回收率实验结果

由表4可知，平均回收率为99.3%～100.5%，相对标准偏差为0.72%～0.98%，表明该方法回收率高，准确可靠。

2.6 稳定性

取同一SAM合成酶活性测定样品和胞内SAM抽提样品，每隔2 h进样测定，平行测定5次，结果见表5。

表5 稳定性实验结果(n=5)

由表5可知，相对标准偏差分别为0.76%和0.69%，表明该方法稳定性良好，能够适用于长时间、多样品的测定。

2.7 SAM合成酶活性测定对照组的考察

在SAM合成酶活性测定过程中需要设置对照组以扣除本底水平的SAM，一般以不加ATP(对照组1)或不加L-Met(对照组2)为对照组。针对两种情况进行考察，结果见表6。

表6 SAM合成酶活性测定对照组的考察

由表6可知，实验组的SAM峰面积为4749.7，而对照组1为98.2、对照组2为33.1，两对照组SAM峰面积差别较小，仅占实验组测定值的1%左右，对测定结果的干扰有限。粗酶液中含有少量的胞内水平的ATP和L-Met，ATP作为一种活性物质，含量较低且稳定性较差，而L-Met相比而言较为稳定。推测用于酶活测定的粗酶液中残留的L-Met参与了对照组1的反应，直接导致了两对照组SAM含量的差异，因此，选择不加ATP的对照组更能反映实际的酶活水平。

3 结论

分析了原有HPLC方法测定SAM存在的问题，针对流动相和洗脱程序进行优化，建立了一种高效、稳定、准确性高的SAM定量检测方法。确定最佳HPLC条件为：254 nm吸收波长下，以5 mmol·L-1和0.5 mol·L-1的甲酸铵在不同时间段以1 mL·min-1的流速进行洗脱。在此色谱条件下，胞内SAM抽提样品和SAM合成酶酶促反应样品中的SAM都能够得到有效分离。该方法简单高效、重复性好、精确度高，并且性能稳定，可以较长时间进行大量样品的准确测定，能够满足发酵过程中菌体胞内SAM产量的测定以及SAM合成酶酶活的监控要求。

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