华南地区汉族人群MDR1基因单核苷酸多态性研究*

2011-07-24 11:25于冰筠胡丽莉
关键词:多态外显子等位基因

于冰筠, 胡丽莉

(1.中山大学生命科学学院,广东 广州 510275;2. 广东药学院生命科学与生物制药学院,广东 广州 510006)

多药耐药基因1(multiple drug resistance 1,MDR1)定位于人类第7号染色体长臂( 7q21.1),其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,,P-gp)由1 280个氨基酸组成,相对分子量质为170 000,是由单一多肽链相连接的两个相似结构域组成,每个结构域均包含6个跨膜a螺旋区和一个ATP结合区。P-gp能够利用ATP水解释放能量,主动将细胞内或细胞膜上的物质泵出细胞[1]。P-gp的生理作用是保护细胞免受毒物或代谢物的损害,同时P-gp转运的底物还包括许多药物[2],因此,MDR1基因产物的表达程度和功能可直接影响这些药物的治疗效果。单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism, SNP)是人类遗传变异中最常见的一种,由于其具有密度高,遗传稳定以及易于实现分析自动化的特点,SNP被认为是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性之后的第三代遗传标记而得以广泛应用,在疾病特别是恶性肿瘤等多基因疾病研究中显示出巨大的优势。单核苷酸多态性(SNP)位点的分布具有明显的种族和地区差异[3],不同个体中MDR1基因多态性与P-gp表达和功能的改变密切相关[4]。最新研究也表明MDR1多态性基因型与肿瘤的易感性、抗肿瘤药物治疗效果以及生存复发等预后密切相关[5-6]。本研究采用PCR-RELP和PCR-SSCP方法对华南地区汉族人群MDR1基因编码区及部分启动子区SNPs位点进行基因分型,并比较不同人种间等位基因频率的差异,为进一步研究华南地区汉族人群MDR1基因SNP与药物效果、药物毒副作用以及疾病易感性之间的相关性提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象

选择华南地区无肿瘤病史、无亲缘关系的汉族健康献血者244例和体检者268例,其中男性296例,年龄19~78岁;女性216例,年龄18~97岁,总平均年龄(44.03 ±0.72)岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和PCR扩增 采用酚-氯仿方法提取外周血基因组DNA。利用primer premier5.0和在线引物设计工具primer3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi),针对目的片段设计相应的引物(引物序列、产物大小和退火温度表略),扩增片段长度在300 bp以下。将20 μL PCR反应体系(2 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTP,0.2 μmol/L引物,0.5 U TaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA,加灭菌的ddH2O至20 μL)混匀离心后置于PCR仪扩增。PCR步骤:① 95 ℃ 4 min;②95 ℃ 1 min,退火温度54~60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;③ 72 ℃ 6 min。取3 μL PCR产物在w=0.8%琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液,100 V恒压下电泳30 min,紫外凝胶成像系统检测PCR扩增产物的特异性和扩增效率。

1.2.2 限制性片段长度多态性(RFLP)分析MDR1基因C3435T(rs1045642,exon26)位点用PCR-RFLP方法进行基因分型,10 μL酶切体系(10×buffer 1 μL,ddH2O 6 μL,限制性内切酶MboI (Fermantas) 1 U,DNA产物3 μL)混匀后37 ℃水浴过夜。取5 μL的酶切产物和1 μL的6 ×Loading Buffer混匀, 加样于w=1.2%琼脂糖凝胶上样孔中,电压90 V,室温电泳50 min。紫外凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 单链构象多态性(SSCP)分析 将2 μL的PCR产物与8 μL的甲酰胺加样缓冲液 (w=95%去离子化甲酰胺, 20 mmol/L EDTA,w=0.05%二甲苯青和溴酚蓝) 混匀;95 ℃变性8 min后置于冰上;加4 μL样于w=8%~10%的聚丙稀酰胺凝胶上样孔中;4 ℃电泳(恒功率4 W 4~6 h)后银染显带。切下SSCP 胶上有泳动异常的条带,ddH2O溶解后置于50 μL体系进行PCR扩增。PCR产物用w=1.5%琼脂糖凝胶电泳分离、DNA凝胶回收试剂盒(U-gene)回收DNA并贮存于-20 ℃冰箱;样品由上海博亚公司测序。

1.2.4 统计分析 采用直接计数法计算华南地区汉族健康人群MDR1基因各SNPs位点的基因型频率,根据Hardy-Weinberg平衡定律直接计算各多态位点在华南地区汉族人群中的预期基因型频率,运用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验,比较观察基因型频率与预期基因型频率之间以及不同人群等位基因频率之间的差异。P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MDR1基因外显子区及部分启动子区SNPs系统筛选

针对MDR1基因28个外显子及部分启动子区域设计引物,用PCR-SSCP或者PCR-RFLP方法先在192个正常人样品中进行SNPs的系统筛选,共检测到5个多态位点。其中一个位于启动子区(图1),一个位于第1外显子的非编码区(图2),这两个SNPs都只有T/T纯合和T/C杂合两种基因型,而未检测出C/C纯合型。另两个SNPs是同义多态,分别位于第12和第26外显子(图3,4),都是从C到T等位基因的变化,但并没有改变相应氨基酸的序列。另一个SNP位于第21外显子(图5),是由G、T、A三个等位基因组成的多态,其编码的893位氨基酸从缬氨酸(Val)变成苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)。其余24个外显子未检测出单核苷酸多态(图略)。

图1 MDR1 基因启动子区T-2410C位多态检测图

图2 MDR1 基因第1外显子T-129C位多态检测图

图3 MDR1基因第12外显子C-1236T位多态检测图

图4 MDR1 基因第26外显子C3435T位多态限制性酶切电泳图

图5 MDR1基因第21外显子G2677T/A位多态检测图

我们将上述5个SNPs位点的检测样品数增至512个,得到这5个多态等位基因在华南地区汉族人群中的分布频率(表1)。用χ2检验这5个多态位点基因型的观察值与预期值,发现无显著差异(P> 0.05),说明这5个多态位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 MDR1基因SNPs在不同人种中的分布

为了分析上述5个SNPs在不同人种中分布频率的差异性,我们将华南地区汉族人群与现有文献报道的其他不同人群中的等位基因分布频率进行比较,发现除了T-2410C以外,其它位点等位基因的分布都存在显著的种族差异。T-2410C位点目前只有一篇文献报道认为-2410C等位基因在日本人群中的分布频率为10% (N= 25)[7],这与我们的结果5% (N= 512) 没有显著差异(P= 0.099)。

表1 MDR1基因上检测到的多态位点及其在华南地区人群中的分布频率

1)后4个多态所在位置以cDNA序列M14758(GenBank)为准,翻译起始位点ATG的A作为+1位,MDR1基因翻译起始位点在第2外显子,-2410 T/C位置的确定是计算了内含子1的核苷酸数目;2) 等位基因频率与第一列等位基因所示顺序相对应。

比较华南地区汉族人群与已报道的其它地区中国人MDR1基因多态的分布频率发现[8-15],除了Tang et al.(2002)报道的G2677T/A位,B. Chowbay et al.(2005)报道的C1236T和C3435T位以外,其余报道的中国人4个位点的分布频率与我们的结果均无显著差异。

为了更简洁明了地分析MDR1基因各多态在不同人种中的分布特点,我们根据等位基因分布频率接近程度以及地域临近等因素,将中国(不包括我们的结果)、日本、韩国和马来西亚人合并称为“东亚人群(East Asian)”[8-20];非籍美国人,加纳人,肯尼亚人,苏丹人合并称为“非洲人群(African)”[9, 12, 19, 21-23];英国,德国,波兰,意大利,西班牙,葡萄牙,俄国等地方的高加索人统称为“高加索人群(Caucasian)”[ 9, 12, 19, 21-22, 24-28],印度地处南亚,加上基因型频率与东亚国家人群的分布频率差异显著[8-10, 13, 23],因此没有与东亚归在一起而单独作为一类人群(图6)。

图6 MDR1基因多态在不同人群之间的分布

结果显示非洲人群与其它人群差别最为显著,1236T,2677T,3435T在非洲人群中的分布频率明显小于其它人群,-129T的频率也较其它人群低。高加索人群与东亚人群除了T-129C位点以外其余等位基因的分布频率均有显著差异,高加索人群1236T等位基因的频率(0.425)比东亚人群(0.640)低,而2677T,2677G和3435T分布频率均较东亚高,但他们之间的差别不如与非洲人群的差别明显。印度人群各等位基因分布与东亚和其它人群也均有显著差异(P< 0.05),-129T,2677T和3435T等位基因频率均较高。总之,4个位点在四类人群中的分布均差异显著。

3 讨 论

在基因组DNA中,任何碱基均有可能发生变异,因此SNPs既可能在基因序列内,也可能在基因外的非编码区序列。但是位于编码区的SNP(cSNPs)比较少,因为在外显子内,其变异率仅为周围序列的1/5,尽管如此,cSNPs在遗传疾病的研究中却有重要意义,其研究也更受关注。2000年,Hoffmeyer S[25]等首次通过DNA全测序对188个高加索人MDR1基因多态进行了系统的筛查,共发现了15个SNPs,其中位于第26号外显子的同义突变C3435T与十二指肠P-gp的表达水平有关并影响肠道对地高辛的吸收。之后,MDR1基因的SNPs筛选工作已在不同人群中展开,到目前为止,在MDR1基因的编码区与非编码区已发现50多个SNPs,但是仍未见报道在中国汉族人群中系统筛查MDR1基因编码区的SNPs。中国民族众多,地域差异大,我们立足于中国本土华南地区汉族人群的MDR1基因外显子区SNPs的系统筛查,进一步完善了中华民族的SNPs谱。

据报道MDR1 功能相关的SNPs有T-129C,C1236T,G2677T/A以及C3435T, 虽然目前的报道结果不大一致,但依旧证明它们与蛋白质的表达量、活性有关,进而影响疾病的易感性和预后。MDR1多态性导致的P-gp蛋白表达水平及活性改变,既会影响有毒物质甚至致癌物的排出而与肿瘤发生相关,又会因过多的泵出抗癌药物而致肿瘤细胞耐药性。其中MDR1 C3435T位点研究得最多,它虽然是一个同义多态,但已有相当多的文献报道它与P-gp蛋白的表达和功能相关,其作用机理可能是: ①发生多态后的亮氨酸密码子是稀有密码子,通过影响翻译效率来影响P-gp蛋白的表达;②单个核苷酸的改变影响mRNA的折叠,从而影响RNA的剪接;③与其它功能多态连锁不平衡,真正作用的是其它位点,它只是起到指示作用。我们研究华南汉族人MDR1基因SNPs分布,可为疾病的发病机理研究,疾病的诊断及治疗提供宝贵的资料。

我们在MDR1编码区只筛查出4个SNPs,都是已报道的等位基因分布频率较高的位点(> 5%)。另外还有一些已报道的位于外显子上的多态在华南地区人群中并没有检测到[29],这些位点大多数只有在高加索人种中有报道,且等位基因频率相对较低。我们未能检测到这些多态可能是由于它们在人种间分布差异造成的。

比较华南地区汉族人群与已报道的中国人群中各位点的等位基因分布频率,发现只有Tang et al[9]报道的G2677T/A位、Chowbay B et al[10]报道的C1236T和C3435T位与我们的结果有差异。有趣的是这些与我们有显著差异报道的人群都是新加坡中国人,而另外一些新加坡中国人4个SNPs的分布频率与我们的结果都无显著差异[11]。新加坡是一个多民族居住的国家,样品的多样性可能导致等位基因分布频率的差异,所以上述新加坡中国人等位基因分布频率的差异可能是由样品选择的差异造成的。另外,MDR1 SNPs在中国本土人群中的分布与我们的结果无显著差异[12-15],这说明我们的结果具有代表性。

进一步比较不同人种之间SNPs分布的差别,发现MDR1 T-129C在各人种中的分布差别很小,除了日本和美籍黑人以外,其他各人群不仅与我们的结果无显著差异,它们之间比较亦无显著差异。这可能是由于-129C等位基因在各人种中分布频率都较小(2%~8%)的缘故,而且到目前为止还没有发现-129CC纯合型基因型,只有-129TT纯合型和-129CT杂合型两种基因型形式,这也降低了其在不同人群众分布的多样性。与此同时,MDR1 G2677T/A在各人种中形成非常多样化的分布,不仅东亚、高加索和非洲人群之间有显著差异,在东亚和高加索人群内部,不同国家差异也十分显著。这可能是因为它是由三个等位基因组成的多态,基因型形式存在多种排列组合,使得等位基因的分布频率更加多样性。

综合4个MDR1 SNPs在不同人群中的分布,发现非洲人群等位基因分布频率与东亚和高加索人群相差很大,东亚和高加索人群虽也有较大的差别,但相对于非洲人群来说又小一些,这一结果与人类进化的理论一致,即非洲的黑人人种与欧洲或美洲的高加索人种和亚洲的蒙古人种是在10万年前就分开了,而东亚和高加索人群是在4万年前才分开的[30]。这些结果提示我们可以从遗传学角度来考虑为什么不同疾病会在不同人群中高发。

同时,我们还发现印度等位基因分布频率与其他人群也有很大差异,不能简单划分到“东亚”、“非洲”以及“高加索”人群中的任何一个。可见,不仅地理因素影响基因型分布,人种的差别是更重要的因素。印度境内有10种以上的民族,人种分布复杂,而参考文献中并没提到所检测的印度人群确切属于哪个人种, 推测这是印度人群与东亚人群及其它人群的基因型分布有区别的原因之一。

人类基因组单核苷酸多态性研究所揭示的人种、人群和个体之间DNA序列的差异以及这些差异所表现的意义将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。今后单核苷酸多态性的研究将在多个领域发挥作用,其中包括:①进行疾病的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析(association analysis),用于疾病易感基因的定位;②在药物基因组学(pharmacogenomics)研究中,通过检测SNPs的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异。这些研究将为“个体化医疗”奠定基础。

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