α-蒎烯促进海洋真菌Aspergillus sp.产真菌毒素青霉酸的研究*

李厚金，谢莹璐，邱小忠，蓝文健

(1. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275；2. 南方医科大学解剖教研室，广州 510515；3. 中山大学药学院，广东 广州 510006)

软珊瑚Sarcophytontortuosum在海南三亚珊瑚礁海区分布较广，采集容易。我们已从该软珊瑚中分离发现了一系列新的、结构独特的、具有抗肿瘤活性的四萜化合物methyl sartortuoate，methyl isosartortuoate，methyl tortuoate A-D[1-5]。软珊瑚体内共附生了大量的微生物，而共附生微生物则是潜在的活性物质的丰富来源。

我们对Sarcophytontortuosum的内生微生物进行了分离培养，得到一批真菌和细菌。对其中的1株内生真菌Aspergillussp.(采集编号SF005)进行了发酵培养，该菌在含葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，100%海水，pH 7.5的培养基(GPY)中，生长良好，能产真菌毒素青霉酸(penicillic acid)，产量为5.5 mg/L。当在GPY培养基中添加200 mg/L的单萜α-蒎烯，能显著促进该真菌产青霉酸，产量可提高至29.15 mg/L。研究发现该菌能将α-蒎烯转化成系列氧化产物，并进一步发生氧化降解。该研究结果表明单萜α-蒎烯是一个有效的诱导子，能引起真菌的氧化应激反应，可提高微生物次生代谢物的产量。

图1 青霉酸的结构式

1 实验部分

1.1 菌种

真菌Aspergillussp. (菌株编号SF005)，分离自海南三亚西岛海域软珊瑚Sarcophytontortuosum的体内。用PDA(potato/ dextrose/ agar) + 100 %海水为培养基，pH 7.5，4 ℃保存。菌种保藏于中山大学化学与化学工程学院天然产物研究室。

1.2 仪器和试剂

日本岛津公司高效液相色谱仪：LC20AT泵，SPD-20A检测器。分析型色谱柱Inertsil®ODS-SP，5 μm，250 mm×4.6 mm；制备型色谱柱Shim-pack PRC-ODS，15 μm，250 mm×20 mm。美国Finnigan公司TRACE DSQ GC-MS 联用仪。

α-蒎烯，分析纯；乙腈，HPLC级，均购于Sigma公司。乙酸乙酯为市售AR 试剂。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏为生化试剂，购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 实验方法

真菌Aspergillussp.发酵的GPY培养基配方为：葡萄糖(10 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母膏(2 g/L)、100 %海水，pH 7.5。

配制20 L GPY培养液，均分成2组，120 ℃灭菌20 min。接入菌种，120 r/min摇瓶室温培养。待培养至第5 d，在其中1组培养瓶中添加200 mg/L的α-蒎烯，继续培养15 d。真菌培养液用乙酸乙酯提取3次，提取液经低温旋转蒸发浓缩得到2种培养条件下的代谢产物提取物。

配制10 L GPY培养液，均分成10组，灭菌后接入真菌Aspergillussp.，培养至第10天，分别收集菌体，菌体分别在无菌条件下转接入1 L已稀释至20%的GPY培养基中，同时添加200 mg α-蒎烯。每隔24 h收取1组真菌的培养液，用乙酸乙酯提取3次，浓缩得到不同时间条件下α-蒎烯的转化产物提取物。

液相色谱实验条件：取1 mg提取物，用2 mL乙腈溶解，进样5 μL。以水和乙腈为洗脱剂，以φ=30%的乙腈洗脱10 min，然后梯度提高乙腈含量，至40 min达100%，并继续恒定至60 min。

气质联用色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升温：初始温度80 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至150℃，保持10 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。 进样口温度250 ℃，氦气为载气，流速为1 mL/min。分流比为30∶1，样品用氯仿溶解，进样量1.0 μL。质谱条件：离子源为EI源，离子源、连接口温度均为230 ℃。

2 结果与讨论

2.1 α-蒎烯对真菌Aspergillus sp.产青霉酸的促进作用

真菌Aspergillussp.在GPY培养基中生长迅速，菌丝体呈白色，并能长出小圆粒状的孢子。其培养液为浅黄色。

10 L GPY培养液提取物为2.28 g，经液相分析，青霉酸为最强峰，保留时间为7.2 min (见图2a)，经制备分离得到纯的青霉酸为55 mg。在添加了α-蒎烯的GPY培养组中，10 L GPY培养液提取物为3.11 g，液相分析其青霉酸的保留时间也为7.2min (见图2b)，经制备分离得到纯的青霉酸为291.5 mg。由此可见，加入α-蒎烯后可以使青霉酸的产量由5.5 提高到29.15 mg/L。

从其HPLC的分析结果还可以看出，在两种培养条件下，其它代谢产物的组成和含量也具有显著的不同。在GPY培养条件下，具有结构独特性的吡嗪类化合物[6]，如3-异丁基-6-(1-羟基-2-甲基-丙基)-2(1H)-吡嗪酮(tR=26.5 min) 和3，6-二异丁基-2(1H)-吡嗪酮(tR=28.2 min)，在添加了α-蒎烯的GPY培养组中并没有检测到。

图2 真菌Aspergillus sp.培养液提取物的高效液相分析结果

2.2 真菌Aspergillus sp.对α-蒎烯的转化

在α-蒎烯的转化培养组中，由于采用了稀释的培养基，有效地去除了代谢产物的干扰。从第1～第10天的转化提取物的GC-MS分析结果来看(第3天的结果见图3)，其转化产物主要为氧化产物(见图4)。在真菌的作用下，α-蒎烯中的碳碳双键易于发生环氧化；其张力相对较大的四元环也易于开环，形成新的不饱和碳碳双键，或者转化成羟基或环氧化物。

图3 真菌Aspergillus sp.对α-蒎烯转化产物的气相色谱-质谱总离子流图

在第1～第10天的结果分析中，仍难以描绘出各种转化产物的变化途径。其原因可能是各种转化反应同时发生的，呈多途径，并有交叉。另外，转化变化也是持续的，各种转化产物都将进一步发生开环、降解，最终生成水溶性的小分子化合物，并有可能被真菌吸收利用。

图4 α-蒎烯的主要转化产物

3 结 论

大量报道表明，海洋微生物代谢产物的产生跟培养条件有很大的关系，同一菌株用不同的培养基可以得到完全不同的代谢产物。目前，人们在研究海洋微生物时，究竟该选用何种培养方法，具有很大的主观性、随机性，而且，对于具体的微生物菌株在某种培养基里能产生何种结构类型的代谢产物也无法预测。在常规培养条件下，很多微生物活性物质的产量低，而且由于结构复杂，也不易于人工合成，对于拿到足够的样品量以满足药理与临床研究，仍有相当困难。因此，深入研究海洋微生物的代谢规律，发展独特的培养技术，实现可人为调控的结构多样的有用代谢产物(包括活性物质)的高效生产，已成为海洋微生物代谢产物研究与开发必须解决的关键问题。

天然单萜的微生物生物转化，能得到大量具有高附加值的含氧芳香萜类产品，在日用化工行业应用前景广阔。然而，此前的研究几乎全是专注于转化产物，并未涉及到微生物的代谢产物变化[7-8]。真菌Aspergillussp.在GPY培养基中添加200 mg/L的单萜α-蒎烯，可以使青霉酸的产量由5.5 提高到29.15 mg/L，提高了5.3倍。转化产物分析发现该菌能将α-蒎烯转化成系列氧化产物，并进一步发生氧化降解。亲脂性单萜可与微生物细胞膜上的磷脂双分子层作用，可改变细胞膜的结构和功能，是“有毒的”，但由于细胞膜具有动态调节能力，维持膜结构，它能通过膜上酶活性的调节，对萜类进行氧化转化，进行“解毒”。细胞膜上的酶是复杂多样的，它们的活性变化，尤其是氧化酶活力的增强，将直接影响到正常的代谢活动，结果必将导致代谢产物的组成和含量改变。本研究结果表明单萜α-蒎烯可以作为一个有效的诱导子，能引起微生物的过敏反应，可提高微生物次生代谢物的产量。

天然单萜，资源极其丰富。微生物培养操作简单、条件温和、无毒、环境友好。研究单萜底物对海洋微生物代谢产物的调控机制，并最终实现可人为调控的有用物质的高效率可持续性规模化生产，也为丰富的天然单萜资源的开发与利用提供新的途径和方法，无疑具有广阔的基础理论研究和应用前景。

参考文献：

[1]苏镜娱, 龙康侯, 彭唐生, 等. 中国软珊瑚化学成分的研究 12.一种新颖独特的四萜酯——扭曲肉芝甲酯的结构测定[J]. 化学学报,1985, 43(8): 796 - 797.

[2]SU J Y, LONG K H, PENG T S, et al. The structure of methyl isosartortuoate, a novel tetracyclic tetraterpenoid from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of the American Chemical Society, 1986, 108(1): 177 - 178.

[3]ZENG L M, LAN W J, SU J Y, et al. Two new cytotoxic tetracyclic tetraterpenoids from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of Natural Products,2004, 67(11): 1915 - 1918.

[4]LAN W J, LI H J, YAN S J, et al. New tetraterpenoid from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2007, 9(3): 267 - 271.

[5]LAN W J, WANG S L, LI H J. Additional new tetracyclic tetraterpenoid, methyl tortuoate D from soft coralSarcophytontortuosum[J]. Natural Product Communications, 2009, 4(9): 1193 - 1196.

[6]LI H J, CAI Y T, CHEN Y Y, et al. Metabolites of marine fungusAspergillussp. collected from soft coralSarcophytontortuosum[J]. Chemical Research in Chinese Universities, 2010, 26 (3): 415 - 419.

[7]蓝文健，李厚金，蔡创华，等. 海洋细菌Aeromonashydrophila和Vibriovulnificus对单萜柠檬烯的生物转化产物分析 [J]. 中山大学学报: 自然科学版, 2006, 45(2): 126 - 128.

[8]李厚金，蓝文健，蔡创华，等. 海洋细菌对柠檬烯的生物转化及萜类产物鉴定 [J].分析化学， 2006, 34(7): 946 - 950.