双羟基脂肪酸异构体的合成及谱学特征*

李 珍，杨得坡，COLIN DUKE，董文其

(1.南方医科大学生物制药系，广东 广州 510515；2.中山大学药学院，广东 广州 510006；3.悉尼大学药学院，NSW2006,澳大利亚)

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一类天然来源的功能性脂肪酸，其主要的活性异构体是9Z,11E-CLA和10E,12Z-CLA[1]。它们具有多种重要的生理功能，如抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力、减肥增肌、促进骨生长等[2]。近年来，尤其是CLA防癌抗癌方面的活性，备受国内外学者关注。最新国外研究报道[3]，在双键的邻位引入羟基(-OH)基团，对抗肿瘤活性能起到一个增效的作用。因此，对其进行结构修饰和改造，是开发新药的一条重要研究途径。本文采用一种快速，便捷的化学方法合成羟基脂肪酸，得到了4个新的双羟基衍生物。通过对化合物的NMR和MS数据分析，揭示它们的化学位移变化规律和质谱裂解规律，阐明其谱学特征，为双羟基脂肪酸异构体的结构鉴定提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

美国Finnigan公司Mat TSQ7000 液相色谱-质谱联用仪，美国Palo Alto公司300 MHz Varian 核磁共振仪，美国Beckman公司半制备高效液相色谱仪。

共轭亚油酸甲酯(φ=95%)，为中山UNICARE公司生产；

叔丁基过氧化氢溶液(φ=70%)，二氧化硒，DMSO，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，盐酸，无水硫酸钠等试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 化学合成方法 在50 mL的圆底烧瓶中加入一定量的SeO2，10 mL 二氯甲烷和适量的TBHP溶液在一定温度下搅拌半小时(600 r/min)，缓慢加入等摩尔比的共轭亚油酸甲酯,反应24 h。反应结束后，加入φ=10% NaCl溶液洗涤2次，收集二氯甲烷层，用旋转蒸发仪挥去溶剂，即得到淡黄色的油状物a。

1.2.2 分离纯化方法 样品溶液的配制：用正己烷将淡黄色的油状物a溶解，配成浓度为100 mg/mL 的溶液供半制备色谱分析。半制备HPLC色谱条件： Alltech硅胶柱(250 mm×100 mm×10 μm)，流动相为正己烷/异丙醇(体积比为98/2)；流速8 mL/min；检测器：示差折光检测器；进样量150 μL。

1.2.3 结构鉴定方法 LCMS/MS分析:LCMS/MS(Finnigen/Mat TSQ7000)，Alltech ODS 毛细管柱(2.1 mm×150 mm)，流动相：40 min内从φ=40%乙腈(φ=60%水；φ=0.5% 甲酸)变化到φ=100%乙腈(φ=0.5% 甲酸)。Bruker BioApex Fourier transform mass spectrometer ESI-MS。正离子ESI模式分析脂肪酸甲酯，负离子ESI模式分析脂肪酸。

1H NMR和13C NMR分析:300 MHz Varian Gemini 300 spectrometer NMR (Palo Alto California,USA)，试剂：CDCl3(Sigma-Aldrich,USA)。

2 结果与讨论

2.1 反应机制

本文首次将SeO2应用于共轭亚油酸甲酯催化合成双羟基脂肪酸甲酯，共轭亚油酸甲酯与SeO2反应，其产物为：9,10(erythro)-双羟基-11E-十八碳烯酸甲酯(3)，10,11(erythro)-双羟基-12E-十八碳烯酸甲酯(4)，11,12(erythro)-双羟基-9E-十八碳烯酸甲酯(5)和12,13(erythro)-双羟基-10E-十八碳烯酸甲酯(6)，如图1所示。

图1 共轭亚油酸甲酯与SeO2的合成反应

由于采用SeO2进行烯丙位加氧是一个经典的方法[4]，本实验最初的目的是用SeO2催化共轭亚油酸合成单羟基共轭亚油酸衍生物。令人感到意外的是，当CLA甲酯与SeO2/t-BuOOH 反应24 h后，得到了Se的复合物，经硅胶柱层析时进行水交换反应，最后得到1，2-双羟基脂肪酸衍生物。1H NMR数据显示有两组1,2-邻氧的质子共振位于δ4.81，4.45和4.28，3.96 处，过硅胶柱之后，这两组峰的化学位移发生了变化，并重叠成一组峰于δ3.86,3.44 处。

经文献检索发现[5]，这是一类关于1,3-二烯与SeO2反应产生1,2- 和1,4-二醇产物的新的反应机理，因此推测该反应的机理如图2，并通过反应产物得到了确认。

图2 共轭亚油酸甲酯与SeO2的反应机理

2.2 半制备HPLC 分离纯化

分离结果如图所示，通过收集峰1，2，3，峰1为两个异构体5，6的混合物，峰2和3为纯度较高的化合物3，4(图3)。

图3 半制备-HPLC 分析结果

2.3 产物结构鉴定及谱学特征

2.3.1 LC-MS/MS分析 对的化合物3，4，5，6进行LC-MS/MS分析。对化合物甲酯用ESI(+)没有得到分子离子峰，而得到了311 [M+1-H2O]+的碎片离子峰。由于化合物甲酯正离子信号很弱，无法得到更多的信息。因此对脂肪酸用ESI(-)模式，得到了各化合物的分子离子峰，如表1所示。化合物3，4，5，6是一组几何异构体,它们的出峰顺序是6=5>4>3。

通过MS/MS(-)分析，得到各化合物的特征碎片离子m/z如下：

6∶313,295,277,213,183,129；5∶313,295,277,199,169,113；4∶313,295,277,215,185,127；3∶313,295,277,201,171,141。

表1 化合物的LC-MS/MS的分析结果

由此推测化合物的裂解机理如下

3：

4：

5：

6：

各个化合物1H NMR和13C NMR数据如下。

化合物(3)∶产率>98%,solid,θmp39～40 ℃。

1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ：5.76 (dt,J=15.4,6.0 Hz,1H,H-12),5.44 (ddt,J= 15.4,7.2,1 Hz,1H,H-11),3.86 (t,J= 6.9 Hz,1H,H-10),3.67 (s,3H,CH3O),3.43 (m,1H,H-9),2.30 (m,2H,H-2),2.05 (m,2H,H-13),1.72-1.17 (m,20H),0.88 (t,J= 6.9 Hz,3H,H-18)。

13C NMR (CDCl3,75 MHz)δ：174.2 (C-1),135.0 (C-11),129.3 (C-12),76.3 (C-10),74.8 (C-9),51.3 (CH3O),34.1 (C-2),33.0,32.3,31.4,29.6,29.3,29.2,29.0,28.8,25.6,25.0 (C-16,15,14,13,8,7,6,5,4,3),22.5 (C-17),13.0 (C-18)。

化合物(4)：产率>98%,solid,θmp36-38 ℃。

1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ：5.75 (dt,J= 15.6,6.4 Hz,1H,H-13),5.44 (ddt,J= 15.6,7.2,1 Hz,1 H,H-12),3.85 (t,J= 6.6 Hz,1H,H-11),3.67 (s,3H,CH3O),3.42 (m,1H,H-10),2.30 (t,2H,H-2),2.05 (m,2H,H-14),1.71-1.14 (m,20H,),0.89 (t,J= 6.9 Hz,3H,H-18)。

13C NMR (CDCl3,75 MHz)δ：174.2 (C-1),134.9 (C-12),129.4 (C-13),76.0 (C-11),74.8 (C-10),51.3 (CH3O),34.1 (C-2),33.0,32.3,31.7,29.2,29.1,29.0,28.9,28.8,25.5,24.9 (C-16,15,14,9,8,7,6,5,4,3),22.5 (C-17),14.0 (C-18)。

由数据分析，不饱和双键上的两个氢原子的偶合常数为J=15.6 Hz，推测不饱和双键为反式(E)构型。接羟基的两个氢原子的偶合常数为J=6.9 Hz，推测为赤式(erythro)构型，并且按照1,3-共轭双键与SeO2的反应机理也可以推测产物都为赤式构型[5]。

3 结 论

SeO2是一种温和的氧化剂，用SeO2进行烯丙位加氧是一个经典的方法。本文将SeO2扩展用于羟基脂肪酸的合成上，SeO2与共轭亚油酸甲酯反应生成了4个新的双羟基衍生物。通过分析推测SeO2与共轭亚油酸甲酯的反应是经一条新的[4+2]反应机理，即1,3-共轭双烯在一定的反应条件下与SeO2形成Se的环状复合物，再进一步转化为1,2-双羟基化合物，这与我们传统认为1,3-共轭双烯与SeO2反应生成1,4-双羟基化合物的结论完全不同，这就为今后SeO2进行烯丙位加氧反应的机理和产物的推测提供了重要的学术参考价值。

参考文献：

[1]PARIZA W，PARK Y，COOK M E. The biologically active isomers of conjugated linoleic acid [J]. Prog Lipid Res,2001,40: 283-298.

[2]CAMPBELL B,KREIDER R B. Conjugated linoleic acids[J]. Curr Sports Med Rep,2008,7(4): 237-241.

[3]RADIN NS. Meta-analysis of anticancer drug structures--significance of their polar allylic moieties[J]. Anticancer Agents Med Chem,2007,7(2): 209-222.

[4]KNOTHE G,BAGBY MO,WEISLEDER D. Fatty alcohols through hydroxylation of symmetrical alkenes with selenium dioxide/tertbutylhydroperoxide[J]. J Am Oil Chem Soc,1995,72,1021-1026.

[5]TRUC M N,DAESUNG L. Formation of syn 1,2- and 1,4-diols via a facile C-Se bond oxidation[J]. Org Lett,2001,20:3161-3163.