分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用

杨 鑫，张 华，董爱军，张英春，赵海田，姚 磊，佘永新，王 静

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.中国农业科学院，北京 100081）

天然产物活性成分是指从植物、动物、微生物和各种自然生物群落、森林、草原、水生生物等再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物的活性成分复杂，既包括多糖、蛋白质、多肽等大分子物质，又包括黄酮、多酚、甾体、生物碱、萜类等小分子物质，衡量天然产物研究和活性物质的质量很大程度上取决于有效成分提取分离的结果。天然产物有效成分分离纯化的难点在于：天然产物的有效成分含量低，难于富集；体系复杂，大分子和小分子、生命和非生命物质共存，特别是存在结构相近的异构体，导致分离纯化难度大，提取纯化工艺繁琐费时；此外，许多天然产物的有效成分稳定性差，对热敏感，易氧化、水解等。

分子印迹技术（Molecular imprinting technology,MIT）又称为分子烙印技术，属于高分子化学、材料科学、生物化学、分析化学等之间的一个交叉学科领域。分子印迹技术是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子（通常称为模板分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术。分子印迹聚合物（Molecular imprinting polymer，MIPs）是指以目标分子为模板分子，将具有结构互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价的方式与模板分子结合，加入交联剂进行聚合反应，反应完成后将模板分子提取出来后形成的一种有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的交联高聚物。分子印迹技术之所以发展如此迅速，主要是因为它具有预定性（Predetermination）、识别性（Recognition）和实用性（Practicability）。由于MIPs具有抗恶劣环境的能力，表现出稳定性强和使用寿命长等优点，因此对其合成及应用研究十分活跃，涉及的范围很广，如手性物质分离，生物传感器，模拟抗体与受体，模拟酶催化，氨基酸及多肽等生物大分子、金属离子、药物分子、天然产物等的分离与纯化。本文主要概述了MIPs的原理及其在天然产物有效成分的分离与纯化方面的应用进展。

1 分子印迹技术基本原理

在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物；然后加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物；最后将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适，这种分子印迹聚合物就象锁一样对此钥匙具有选择性。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。分子印迹技术基本原理如图1所示[1-2]。

2 分子印迹聚合物制备方法

2.1 本体聚合法

本体聚合法（Bulk polymerization）是目前最常用的，也是最经典的一种方法。合成过程是将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在适当的溶剂体系中，然后置入具塞瓶中，超声后充氮除氧，密封，通过热聚合或光聚合一定时间，得到的块状聚合物，即为MIPs。然后经粉碎、研磨、过筛获得合适大小的微粒，再经索氏提取洗脱除去模板分子，真空干燥后备用。本体聚合法对模板分子具有良好的选择性和识别特性，其合成和操作条件易于控制，便于普及。但是，该法获得的聚合物颗粒不均一、产量低；作为柱填料使用时，柱效低、分压高，且吸附量不高；模板的除去困难，导致使用过程中模板渗漏[3]。

图1 分子印迹技术原理Fig.1 Molecular imprinted technology

2.2 沉淀聚合法

沉淀聚合法（Precipitation polymerization）是近年来被广泛采用合成分子印迹微球的一种方法，又称非均相溶液聚合。在引发剂的作用下，反应产生自由基引发聚合成线型、分支的低聚物，接着低聚物交联成核从介质中析出，相互聚集而形成聚合物粒子，这些聚合物粒子与低聚物及单体最终形成高交联度的聚合物微球。沉淀聚合法实验过程简单，无需研磨。但为避免团聚，合成的微球通常只能在低粘度的溶剂中进行，因此对溶剂的粘性要求较高[4-5]。

2.3 悬浮分散法

悬浮聚合法（Suspension polymerization）也是目前制备球型分子印迹聚合物的一种常用方法。近年来，许多学者利用各种新型分散剂制备分子印迹聚合物微球取得了新的进展[6]，其反应体系一般由单体、脂溶性引发剂、分散剂和水组成。合成过程是先用有机溶剂将单体溶解，加到溶有稳定的水或其他强极性的溶剂中，高速搅拌获得悬浊液，然后加入引发剂，引发聚合获得分子印迹聚合物微球。尽管悬浮聚合方法获得的聚合物吸附效果较好，但其制备过程较为复杂，通常需要昂贵的分散剂和惰性分散体系[7]。

2.4 表面印迹法

表面印迹聚合法（Surface imprinting ploymerization）起源于硅胶表面处理和衍生的方法，是一种在固体表面进行分子印迹聚合的技术。合成过程是先将模板分子与功能单体在一定的有机溶剂中反应形成加合物，然后将其与表面活化后的硅胶、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TRIM）粒子和玻璃介质反应嫁接形成聚合物。表面印迹法解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的问题，形成的聚合物可以使底物更容易接近活性点。此外，该法即可改变载体树脂的交联度，也可调整孔结构，得到小粒径和窄分布的载体，因而可用于色谱柱中[8]。

3 分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用

3.1 生物碱类活性成分的分离纯化

生物碱一般指存在于生物体内的碱性含氮化合物，多数具有复杂的含氮杂环，有碱性和显著的生理活性。一些生物碱因具有抗肿瘤、抗癌、低毒、低成本的特点，最近已成为人们研究的焦点。科学、高效地从植物中提取和分离纯化生物碱成分是扩大其实际应用的核心问题。近年来生物碱类活性成分的提取已成为分子印迹技术领域的研究热点[9]。

3.1.1 茶碱

Mosbach等在1993年首次利用药物茶碱与甲基丙烯酸（MA）之间可氢键键合，制成了药物茶碱分析用色谱固定相。由此方法已合成了对药物、生物活性物质、酶等有识别功能的树脂、凝胶固定相等高分子材料，使分子烙印从最初的手性体分离材料制备和手性体分离这一单一应用范围迅速地扩展到化学、生物、医药等各个领域[10]。Kobayashi等首次采用湿相转化技术制备了茶碱的MIPs薄膜。这个薄膜是丙烯腈-丙烯酸的共聚物。吸附试验发现，该分子印迹膜为不对称结构，包含一致密表层与一多孔支撑亚层，对茶碱的吸附量远大于咖啡因。这表明在相互转化的过程中，MIPs记录了茶碱分子的形状。通过对薄膜的表征，发现了茶碱和共聚物间相互作用的证据[11]。王红英等采用相转化法制备具茶碱分子识别功能的（AN-CO-AA）高分子膜，对茶碱等有机碱有很高的立体选择性。FT-IR及NMR测试结果表明，制备的高分子膜中，茶碱模板分子和膜中的丙烯酸功能残基存在着良好的氢键键合作用[12]。王靖宇等采用自由基热聚合法在PVDF中空纤维膜表面制备茶碱分子印迹膜，采用SEM测试手段对膜聚合前后的表面形貌进行表征，证明分子印迹膜表面聚合层的存在，并将所得分子印迹膜及空白膜组装成膜组件，以膜色谱形式应用于茶碱和可可碱混合物的萃取分离，比较了相同条件下空白膜和印迹膜对茶碱和可可碱选择性吸附性能，同时考察了不同浓度混合液和不同乙酸酸度的甲醇萃取液对过滤结果的影响。结果表明，印迹膜的选择性因子随混合液浓度和萃取液中乙酸含量的增加而降低[13]。

3.1.2 咖啡因

颜流水等采用分子印迹技术建立了一种新型高选择性分离测定咖啡因的微柱液相色谱法。在该方法中，以咖啡因为模板分子，经紫外光引发原位聚合制备了分子印迹毛细管整体柱。考察了柱制备过程中影响柱性能的主要因素，优化了色谱分离条件。结果显示所制备的分子印迹整体柱对咖啡因具有高度选择性，咖啡因与其结构相似物的最高分离度为2.57。将这一方法用于测定绿茶饮料、百事可乐和复方药片中咖啡因含量，获得满意结果[14]。陈移姣等以咖啡因为模板分子，采用水溶液悬浮聚合法制备了用于色谱分离（作HPLC的固定相）的微米级分子印迹聚合物微球（MIPMs）。结果表明当以茶叶碱为竞争分子时，MIPMs对咖啡因有强的吸附和特异性选择识别能力，能满足茶叶中咖啡因分离富集的需要，这为在天然物中质量分数低、药效高的成分的鉴定分析和分离纯化提供了方法借鉴[15]。

3.1.3 士的宁

张静等以士的宁为模板分子，采用原位分子印迹技术，合成了士的宁分子印迹整体柱。通过优化合成条件，确定了模板分子、功能单体与交联剂之间的比例以1∶4∶16最佳；对士的宁整体柱的色谱条件包括流动相组成、流速、柱温等进行了考察，并用于士的宁和马钱子碱的分离，其分离因子为3.5[16]。

3.1.4 奎宁

张春静等采用多孔醋酸纤维膜为支撑体，制备了奎宁分子印迹复合膜，并对膜的选择结合性及分离性能进行了研究。研究结果表明，奎宁分子印迹复合膜对模板分子奎宁具有较好的选择结合性，奎宁在膜上结合量达到20.6 μmol·g-1，奎宁/辛可宁的分离因子则为5.6；膜透过实验表明辛可宁透过奎宁分子印迹复合膜速率远大于奎宁的透过速率，该透过机理符合膜渗透的“溶解-扩散”模型[17]。何建峰等也以奎宁分子为模板，甲基丙烯酸为功能单体，在亲水体系中利用两步种子溶胀和微乳液聚合的分子印迹技术，成功制备得到一种单分散性好的球形分子印迹聚合物。用红外光谱、热重分析、电镜扫描、粒度分析等技术对聚合物进行了表征。通过聚合物在不同溶剂中的吸附量的变化，揭示采用酸性的功能单体MAA制得的聚合物可与带胺基的模板分子通过氢键、离子键（静电）相互作用，且识别机理随溶剂类型改变而改变。对不同底物的选择性实验表明该聚合物对模板分子具有良好的识别能力和选择性[18]。

3.1.5 苦参

Lai等以苦参碱为模板制作了分子印迹膜，从槐属植物苦参中提取分离苦参碱。结果分子印迹膜对苦参碱的回收率可达到71.4%[19]。以上研究结果表明，分子印迹膜的最大特点就是对模板分子的识别具有可预见性，对于特定物质的分离极具针对性。其中分子印迹复合膜又将膜分离的可连续化操作特点与分子印迹技术进行了结合，是最有应用前景的一种膜技术。

3.2 黄酮类活性成分的分离纯化

黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，其在植物体内大部分与糖结合成苷类，有一部分是以游离态的形式存在。绝大多数的植物体内都含有黄酮类化合物，其对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病等方面起着重要的作用。同时，黄酮类化合物分布广泛，生理活性多种多样，如槲皮素、芦丁、葛根素等具有扩冠活性，牡荆素、汉黄岑素等具有抗肿瘤活性等，因此引起了人们的广泛研究。而近年来，黄酮类化合物的研究已倾向于其药用价值的开发，更多地涉及了提取分离工艺的应用研究、黄酮类化合物的含量测定及制剂等[20-21]。

3.2.1 葛根素

程绍玲等以葛根素为模板分子，丙烯酰胺为单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，制备了葛根素的MIPs。该MIPs对葛根异黄酮有很好的印迹作用，可有效地从葛根提取物中分离出葛根素、大豆苷元和大豆苷。该研究为葛根有效成分的分离提供了一种新的方法[22]。

3.2.2 槲皮素

谢建春等采用非共价法，在极性溶剂中，以丙烯酰胺为功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了MIPs。液相色谱实验结果表明，该MIPs对槲皮素具有特异的亲和性，将此MIPs直接用于银杏叶提取物水解液的分离，得到主要含模板槲皮素及与槲皮素结构相似的化合物山柰酚两种黄酮类组分[23]。为进一步验证上述结论，谢建春等以槲皮素为模板，在四氢呋喃中采用非共价键法制备了MIPs，从沙棘粗提物中分离得到了治疗心血管疾病的主要活性成分槲皮素和异鼠李素[24]。此外，Theodoridis等合成了可选择性吸附芦丁和槲皮素的MIPs，在印迹过程中，以这两种类黄酮为模板分子，通过非共价方法制备MIPs。通过液相色谱和固相萃取研究证实，合成的MIPs具有印迹效果，从红酒、白酒、橙汁和茶中预富集了类黄酮组分[25]。颜流水等通过分子印迹技术，利用热聚的方法，以槲皮素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，成功地合成了槲皮素MIPs[26]。该MIPs对槲皮素有很高的亲和性。

3.2.3 芦丁

张裕卿等利用分子印迹技术，以水溶性黄酮芦丁为模板剂与具有专一识别官能团的氯丙基三乙氧基硅烷反应制备出前驱物，然后将前驱物与正硅酸乙酯进行协同水解、凝胶老化和模板剂的洗脱，从而制备出对芦丁具有高效选择性的内置型硅质吸附剂。结果表明，该吸附剂具有较高的吸附容量，即使在有与芦丁结构相似的黄酮存在下，对芦丁依然有较高的选择性吸附能力；TEM照片表明该吸附剂具有与印迹分子相匹配的纳米孔洞，而对FTIR光谱分析表明该吸附剂在印迹识别过程有新的化学键生成[27]。

3.2.4 非瑟酮

非瑟酮是中药黄栌的主要组成成分，属于天然类黄酮物质，具有抗炎、抗菌作用。李礼等以中约黄栌的主要成分非瑟酮为印迹分子、丙烯酰胺为功能单体及乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过封管聚合法合成了分子印迹填充膜；通过优化清洗及洗脱条件，用固相萃取使非瑟酮与它的结构相似物槲皮素在柱上得到了很好的分离[28]。

3.2.5 山奈酚

贺敏强等采用分子印迹技术，以山奈酚（Kaempferol，KAE）为模板分子，2-乙烯基吡啶（2-Vpy）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，合成了山奈酚分子印迹聚合物（KAE-MIP）。采用静态平衡结合实验评价了KAE-MIP对底物分子的结合特性，并进行了吸附动力学研究。结果表明，KAE-MIP对KAE呈现出很强的选择吸附特性；Scatchard分析显示KAE-MIP对KAE存在不同亲和力的两类结合位点；与对照物在KAE-MIP上的吸附行为比较表明，KAE-MIP对KAE具有良好的分子识别性能；KAE-MIP对KAE的选择性吸附基本在2 h之内完成[29]。

3.2.6 木犀草素

肖淑娟等采用分子印迹技术，以木犀草素为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、EGDMA为交联剂，合成了木犀草素印迹聚合物。将该印迹聚合物用于固相萃取，分离提取花生壳中的木犀草素。结果表明，该印迹聚合物对木犀草素具有较强的吸附性能和选择性，用印迹柱萃取得到的木犀草素纯度高出硅胶柱分离近20个百分点，达到96.2%。且MIPs-SPE柱与普通的硅胶柱相比，经过洗脱再生后可以反复使用多次[30]。

3.3 多元酚类活性成分的分离纯化

3.3.1 柯里拉京

柯里拉京（Corilagin）亦称为云实精，是一种具有抗纤溶活性、抗肿瘤以及抑制乙肝病毒作用的天然多酚类化合物，是叶下珠、老鹳草、蜜柑草等植物中的有效成分[31]。袁小红等以柯里拉京为模板分子，采用本体聚合法，合成了对柯里拉京分子具有高选择性的分子印迹聚合物，对其分子识别能力进行研究，结果表明，以丙烯酰胺为功能单体得到的聚合物对模板分子柯里拉京的分子印迹效率高[32]。这为进一步研究以该分子印迹聚合物为萃取材料，富集、萃取、分离复杂中药体系中的柯里拉京及其结构类似物提供了重要的手段。

3.3.2 茶多酚

茶多酚中的儿茶素类成分结构相似，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和其对映体没食子儿茶素没食子酸酯（GCG），用常规方法难以分离。钟世安等以EGCG为模板分子，α-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在光冷引发条件下合成了EGCG的MIPs；利用该MIPs制备了固相萃取柱，并用于提取茶叶中的茶多酚。他们还对提取条件进行了优化，结果表明，在萃取柱上载样品之后，先用甲醇一水（体积比为1∶9）混合液进行清洗，再用甲醇一乙酸（体积比为9:1）混合液进行目标分子的洗脱，可以得到比较纯（92.4%）的目标物EGCG，该提取步骤中EGCG的回收率达到了69.3%。分子印迹柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用20次后其选择性识别能力仍未降低，但空白印迹柱却没有这样的选择性识别能力[33]。

3.3.3 白藜芦醇

白藜芦醇具有明显的抗菌、抗炎、抗血栓、抗高血脂等作用，对心血管病有明显的疗效[34]。向海艳等采用分子印迹技术，以白藜芦醇为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，EGDMA为交联剂，合成了对天然活性物质白藜芦醇具有较好选择性的印迹聚合物。通过静态平衡结合法以及Scatchard分析法研究了该聚合物的结合能力和选择性能。结果表明，该印迹聚合物中形成了两类不同的结合位点，其离解常数分别为 9.9×10-5moL·L-1和 1.7×10-3mol·L-1。与化学组成相同的相应非印迹聚合物相比，白藜芦醇分子印迹聚合物对白藜芦醇有较强的吸附性能和选择性。将该印迹聚合物用于分离中药虎杖提取液中的白藜芦醇，得到良好的效果[35]。洪美花等以聚苯乙烯微球为种球，白藜芦醇为模板分子，采用单步溶胀聚合法在N，N-二甲基甲酰胺体系中制备了单分散分子印迹聚合物微球。用扫描电镜对微球的结构和形貌进行了表征，并研究了微球的制备条件和吸附特性。微球的凹陷可有效地增加微球的比表面积和结合位点，从而提高了模板分子的结合速率及微球的印迹容量[36]。

3.3.4 和厚朴酚

王婧等采用单步溶胀聚合法制备了和厚朴酚分子印迹聚合物微球（MIPMs）。Scatchard分析表明分子印迹聚合物微球在识别和厚朴酚分子的过程中存在两类结合位点，其高亲和位点的解离常数为KD1=0.13 mmol·L-1，最大表观结合量Qmax=45.21 μmol·g-1。静态吸附试验证明MIPMs对模板分子具有较强的特异吸附能力，以厚朴酚为竞争底物，其分离因子达1.85[37]。

3.4 甾体类类活性成分的分离纯化

甾体类化合物的结构相似，其物理、化学性质非常接近，采用一般的化学方法很难对其中某一组分进行分离纯化和定量测定。甾体分子大多含有一个刚性骨架和羟基取代基，因而可利用羟基和功能单体形成氢键或酯键制备相应的MIPs，使之得到高效的分离[38]。近年来用MIPs提取甾类分子已引起人们越来越多的关注，其中应用最广泛的是人体内的一些活性物质，如胆固醇、睾丸激素、皮质醇等的提取。采用非共价键法Ramstrtim等首次制备了皮质醇分子印迹体系，但是聚合物对皮质醇的选择性较低[39]。针对上述问题，Baggiani等研究了聚合物对皮质醇的吸附和选择性能，发现以皮质醇为印迹分子的MIPs对目标分子显示了良好的选择性，可以明显的和其他结构类似的化合物区分开来[40]。Sreenivasan等采用非共价键法，利用极性不同的两种单体制备了胆固醇和睾丸激素的分子印迹聚合物。研究了不同极性聚合物对胆固醇和睾丸激素的选择性和吸附量，结果显示极性小的单体聚合物对胆固醇具有较大的吸附量，反之，对睾丸激素具有较大的吸附量[41]。采用共价键方法Kugimiya等利用p-2-乙烯基苯硼酸和油菜素甾酮中的两组顺式羟基发生酯化作用，制备了植物甾族激素油菜素甾酮的分子印迹聚合物[42]。虽然共价键方法的制备过程比较复杂，但是该法所得的MIPs对模板具有很强的选择性吸附，能够避免同样具有顺式羟基的雌激素三醇等成分的干扰。

3.5 萜类活性成分的分离纯化

齐墩果烷是白色针晶，属于三萜类化合物，具有护肝降酶、抗炎、强心利尿、抗肿瘤等药效，但是采用常规的提取分离方法对其提取效率不高[43]。Claude等用齐墩果烷三萜化合物为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，氯仿为致孔溶剂，通过热聚法合成了MIPs，其印迹效果显著，对齐墩果烷三萜的吸附容量为0.94 mg·g-1。四个结构相似的齐墩果烷三萜化合物被用于评价该MIPs的选择性，结果表明三萜骨架上官能团的影响很显著。用该MIPs可以从甘草根中提取18-β-glycyrrhetinicacid，且收率达到了98%[44]。

3.6 对手性异构体及结构类似物的分离

3.6.1 辛可宁

黄晓冬等采用原位聚合的方法直接在毛细管柱中合成出辛可宁印迹聚合物。该聚合物与毛细管内壁共价结合连为一体形成整体式毛细管柱，扫描电镜显示其具有较大的流通孔结构。采用压力辅助毛细管电色谱模式拆分了非对映异构体抗疟药物辛可宁和辛可尼丁，柱效远高于其在高效液相色谱分离中的柱效。考察了电压、外压、温度、流动相表现pH和乙腈含量对分离结果的影响。通过条件优化，可以在2 min内完成辛可宁和辛可尼丁的快速分离[45]。

3.6.2 伪麻黄碱

Beach等以(-)-伪麻黄碱和(-)降麻黄碱为模板，制得MIM作为薄层色谱的手性固定相，不仅实现了对相应模板分子的识别，而且还能分离出结构类似的手性化合物麻黄碱和副肾碱[46]。由此看出，以活性成分为模板分子合成相应的MIM，可直接从中药中分离与模板分子结构类似、生理活性相似的成分，避免了传统分离的低效性。目前该技术已广泛应用于临床药物的手性分离和分析。研究的分离对象包括药物、氨基酸及衍生物、肽及有机酸等。

3.7 在其他领域的应用

分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要方面。分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比，具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破坏，可多次重复使用，易于保存等优点，且较生物材料易得，可用标准化学方法合成。因此其膜适合作为灵敏度较高的传感器，目前已被用作传感器的敏感部件，用于识别氨基酸[47-48]、除草剂[49-50]、神经毒剂[51-52]等多种物质。

4 结语与展望

天然产物是一个非常复杂的体系，如何从复杂的天然产物中提取和分离出有效成分，是当前加快天然产物现代化进程的一个重要问题。但是，目前天然产物的分离纯化仍然是一项相对繁琐、耗时的工作。当一个具有开发价值的天然化合物被发现之后，如何能找到一种高效且低成本的分离方法便成为关键。MIT作为中药活性成分提取的一种新技术，其最大特点是用已知的化合物为印迹分子，合成化合物的印迹聚合物，对中药提取液进行高通量筛选，再结合色谱等进行结构确认[53-54]。虽然MIT已广泛应用于各个领域并取得了显著成果。但作为一种新型的分离技术，其本身在理论和应用等方面还存在许多有待解决的问题。首先，分子印迹技术的机理研究相对肤浅，还处于定性和半定量的阶段，结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理不够明确，需进一步从分子水平上弄清楚分子印迹和识别的过程，定量描述其机理，以提高MIPs制备的预知性和可控性。其次，目前MIPs的制备和应用大多数只能在有机相中进行，如何利用特殊的分子间作用力在水溶液中或极性溶液中进行分子印迹以便接近或达到天然分子识别系统水平，将分子印迹和识别过程从亲脂性药物拓展到亲水性药物尚待研究。第三，目前功能单体的种类太少，且价格昂贵，不能满足某些分子的识别要求，更不能满足其实际生产的需要，新的功能单体的合成迫在眉睫。第四，现在所用的模板分子多为酸性或碱性的小分子苷元，如何将分子印迹研究领域从目前的小分子领域拓展到诸如蛋白、核酸、多糖等大分子领域，甚至拓展到超分子水平的细胞与病毒，对分子印迹技术来说具有里程碑意义。

[1]陈建新,吴洪,姜忠义.分子印迹技术在化学反应中的应用[J].化工进展,2003(12):1296-1303.

[2]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学评述与进展,2006(7):1035-1041.

[3]Yoko N,Hitoshi M,Kazuyoshi Y,et al.Selective recognition of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a molecularly imprinted polymer[J].Analytical Letters,1998,31:973-980.

[4]Powley C R.Handbook of residue analytical methodsfor agrochemicals[M].Fohm:Wiley&Son Ltd,2003:400-411.

[5]Boonpangrak S,Prachayasittikul V,Bülow L,et al.Molecularly imprinted polymer microspheres prepared by precipitation polymerization using a sacrificial covalent bond[J].J Appl Polym Sci,2006,99:1390-1398.

[6]Mullettw M,Lai P C,Sellergren B.Determination of nicotine in tobacco by molecularly imprinted solid phase extraction with diffrential pulse de1ution[J].Anal Commun,1999,36(6):217-220.

[7]Lai E P C,Fafara A,Vandernoot V A.Molecularly imprinted solid phase extraction micro-column with differential pulsed elution for theophylline determination[J].Can J Chem,1998,76:265-273.

[8]Sergeyeva T A,Piletska O V,Piletsky S A.Data on the structure and recognition properties of the template selective binding sites in semi-IPN-based molecular imprinted polymer membranes[J].Mater Sci Eng C,2008,28:1472-1479.

[9]单伟光,张轶,唐岚,等.分子烙印技术分离识别生物碱成分的研究进展[J].浙江工业大学学报,2009,37(1):1-5.

[10]Vlatakis G,Andersson L I,Mosbach K,et al.Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting[J].Nature,1993,361(6413):645-246.

[11]Kobayashi T,Wang H Y,Fujii N.Molecular imprint membranes of polyacrylonitrile copolymers with different acrylic acid segment[J].Analytica Chimiea Acta,1998,365:81-88.

[12]王靖宇,许振良,张颖.茶碱分子印迹膜色谱的性能[J].膜科学与技术,2010(5):37-42.

[13]王红英,吕秋丰,曹少魁,等.用分子复制法制备具有分子识别功能的高分子膜[J].北京大学学报:自然科学版,2001,37(2):244-250.

[14]颜流水,王宗花,罗国安,等.分子印迹毛细管整体柱液相色谱法测定咖啡因[J].分析化学,2004,32(2):148-152.

[15]陈移姣,周兴国,李桂玲.悬浮聚合法制备咖啡因分子印迹聚合物微球及其性能研究[J].中草药,2005,36(5):692-695.

[16]张静,贺浪冲,傅强.体液中微量士的宁的富集及同时检测[J].法医学杂志,2005,21(1):36-38.

[17]张春静,钟世安.醋酸纤维-奎宁分子印迹复合膜的制备及分离性能研究[J].膜科学与技术,2008,28(4):59-62.

[18]何建峰,刘岚,杨桂兰,等.水相中奎宁分子印迹聚合物的制备、表征及识别性质的研究[J].中山大学学报:自然科学版,2005,44(3):58-62.

[19]Lai J P,He X W,Jiang Y,et al.Preparative separation and determination of matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid phase extraction[J].Anal Bioanal Chem,2003,375(2):264-269.

[20]徐宁,张峰,肖远胜,等.中药黄酮类化合物[J].大学化学,2010,25(B04):105-108.

[21]周媛媛,孟子晖,董美伶.分子印迹技术在天然产物有效成分分离纯化中的应用[J].色谱,2009,27(3):359-363.

[22]程绍玲,杨迎花.利用分子印迹技术分离葛根异黄酮[J].中成药,2006,28(10):1484-1488.

[23]谢建春,骆宏鹏,朱丽荔,等.利用分子烙印技术分离中草药活性组分[J].物理化学学报,2001,17(7):582-585.

[24]周力,谢建春,戈育芳,等.分子烙印技术在沙棘功效成分提取中的应用[J].物理化学学报,2002,18(9):808-810.

[25]Theodoridis G,Lasakova M,Skerikova V,et al.Molecular imprinting of natural flavonoid antioxidants:Application in solidphase extraction for the sample pretreatment of natural products prior to HPLC analysis[J].J Sep Sci,2006,29(15):2310-2321.

[26]颜流水,井晶,黄智敏,等.槲皮素分子印迹聚合物的制备及固相萃取性能研究[J].分析试验室,2006,25(5):97-100.

[27]张裕卿,秦震,马振荣.新型硅质吸附剂的合成及对黄酮的选择分离[J].天津大学学报,2007,40(4):411-415.

[28]李礼,胡树国,何锡文,等.应用分子印迹一固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮[J].高等学校化学学报,2006,27(4):608-611.

[29]贺敏强,万金城,孟敏佳,等.山奈酚分子印迹聚合物的制备及其性能表征[J].化学世界,2010,11:670-674.

[30]肖淑娟,李红霞,于守武.分子印迹固相萃取法提取花生壳中木犀草素[J].化工进展,2010,(2):293-296.

[31]刘朝阳,陈玉武.柯里拉京抗肿瘤作用的研究[J].肿瘤防治研究,2002,29(5):356-358.

[32]袁小红,徐筱杰.两种功能单体制备柯里拉京分子印迹聚合物的比较[J].广州中医药大学学报,2007,24(6):520-522.

[33]钟世安,贺国文,雷启福,等.儿茶素活性成分分子印迹聚合物的固相萃取研究[J].分析试验室,2007,26(10):1-4.

[34]张宝红.白藜芦醇药理研究进展[J].现代医院,2008,8(3):66-68.

[35]向海艳,周春山,钟世安,等.白藜芦醇分子印迹聚合物合成及其对中药虎杖提取液活性成分的分离[J].应用化学,2005,22(7):739-743.

[36]洪美花,陈元涛,王婧,等.白藜芦醇分子印迹聚合物微球的制备及特性评价[J].天然产物研究与开发,2010(4):559-563.

[37]王婧,陈元涛,洪美花,等.和厚朴酚分子印迹聚合物微球的制备及表征[J].化学世界,2010(10):598-601.

[38]张杰,王永健,于奡.分子印迹技术在甾类物质识别和分析中的应用[J].化学试剂,2005,27(6):331-335.

[39]Ramstrtim O,Ye Lei,Mosbach K.Artificial antibodies to c orticosteroids prepared by molecular imprinting[J].Chem&Bio1,1996,3(6):471-477.

[40]Baggiani C,Giraudi G,Trotta F,et a1.Chromatographic characterization of a molecular imprinted polymer binding cortisol[J].Talanta,2000,51(1):7l-75.

[41]Sreenivasan K.Effect of the type of monomers of molecularly imprinted polymers on the interaction with steroids[J].Appl Polym Sci,1998,68(11):1863-1866.

[42]Kugimiya A,Matsui J,Abe H,et al.Synthesis of castasterone selective polymers prepared by molecular imprinting[J].Analytica Chimica Acta,1998,365(1-3):75-79.

[43]张宪民,周激文.昆明山海棠根的齐墩果烷型三萜成分[J].云南植物研究,1993,15(1):92-96.

[44]Claude B,Morin P,Lafosse M,et al.Selective solid-phase extraction of a triterpene acid from a plant extract by molecularly imprinted polymer[J].Talanta,2008,75(2):344-50.

[45]黄晓冬,孔亮,厉欣,等.原位分子印迹毛细管电色谱柱的制备及其对非对映异构体的分离[J].色谱,2003,21(3):195-198.

[46]Beach I V,Sbea K J.Designed catalysts.A synthetic net work polymer that catalyzes the dehydrofluorhration of 4-fluoro-4-(pnitropheny1)butan-Z-one[J].JAmChemSoc,1994,116:379-380.

[47]孔泳,黄刚堂,陈智栋,等.识别酪氨酸对映体的分子印迹电化学传感器[J].理化检验:化学分册,2007,43(12):997-1003.

[48]常平平,章竹君.基于分子印迹识别的化学发光传感器测定人血清中的游离羟脯氨酸[J].分析化学,2009,37(A03):280-280.

[49]张雁,康天放,鲁理平,等.对硫磷分子印迹膜传感器的制备及识别特性[J].环境科学,2008,29(4):1072-1076.

[50]蒋复阳,李建平.利用分子印迹传感器选择性测定绿麦隆[J].分析测试学报,2010,29(5):469-472.

[51]何德勇,章竹君.氯丙嗪分子印迹化学发光微流控传感器芯片的研究[J].分析试验室,2008,27(9):37-40.

[52]刘晓芳,李锋,姚冰.地西泮分子印迹聚合物的光谱学特性及其在传感测试中的应用[J].光谱学与光谱分析,2010(8):2228-2231.

[53]彭晓霞,迟栋,龚来觐.分子印迹技术在中药提取分离中的应用[J].中国中医药信息杂志,2009,16(1):102-104.

[54]陈晖,戴红霞.分子印迹技术在中药研究中的应用[J].亚太传统医药,2009,5(3):138-140.