ICP胎鼠心肌损害机制的实验研究

陕西省妇幼保健院产三科 (西安 710004)董莉洁 曹引丽

妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)可导致早产、新生儿窒息、围产儿死亡、新生儿神经系统后遗症等[1]。胎儿宫内病死率可达 2%。更有研究指出 ,不明原因的死胎、死产中有半数是由 ICP引起的[2]。近年来一系列研究表明[3]胆汁酸对未成熟心肌细胞有明确的毒性作用 ,可能是 ICP时胎儿心肌损伤的重要原因。本次实验拟通过制备 ICP动物模型检测孕鼠血清中的心肌酶谱的变化,观察不同程度 ICP胎鼠心肌细胞结构的病理改变及线粒体氧化应激,研究 ICP胎鼠心肌损伤机制,并进一步探讨 ICP孕妇胎儿猝死的原因。

材料与方法

1 实验动物 实验用清洁级 SD雌性大鼠(由第四军医大学实验动物中心提供),体重 200～ 220g,年龄 150～ 170d;室温 18～ 20℃,相对湿度 40%～ 70%;不限制饮水和饮食;于发情期与雄性 SD大鼠 1∶1合笼饲养,每天观察粪盘内有无脱落的阴栓蜡块,阴栓脱落日定为妊娠第 1天,分笼饲养待用。主要试剂为苯甲酸雌二醇(2 mg/ml),

2 方 法

2.1 动物模型制备:依据相关文献及临床研究结果[4,5],取孕 14d SD大鼠 60只,随机分为对照组和高、低雌激素组,每组 20只,分别在后肢内侧 3ml/(kg◦d)的生理盐水,1次 /d及皮下注射剂量为 5.0(高剂量 )1.2.mg/(kg◦ d)(低剂量)苯甲酸雌二醇连续 5d,孕 20d以氯安酮 120g/kg麻醉孕鼠剖宫取胎,收集一窝胎鼠,留取胎心待测。

附表 胎鼠血清生化指标和心肌酶谱变化情况

图1 胎鼠心肌病理结构 HE染色结果(左:高浓度组 200×;右:对照组 200×)

2.2 标本的采集及处理:每组孕鼠于孕 14d建模 前及 20d(120mg/kg氯胺酮麻醉后)剖宫产前从眶静脉采取全血 2ml室温下静置 3min,离心 10min后取血清 1ml检测各项指标。同时剖开子宫,收集一窝胎鼠,逐个称重,提取心肌及线粒体,检测线粒体活性氧簇。

结 果

1 胎鼠血清生化指标和心肌酶谱的变化,见附表。

2 心肌病理结构及对线粒体活性氧簇的改变。

2.1 胎鼠心肌病理结构 HE染色结果,见图 1。结果表明,高浓度组胎鼠心肌细胞萎缩,体积缩小,胞浆染色浅淡,形状不规,细胞间隙显著增宽,被脂肪充填,胞浆内可见较多嗜酸性颗粒沉积,局部胞浆溶解、核消失;低浓度及对照组心肌细胞病理无明显改变。

2.2 MXC对活性氧簇生成的影响,见图 2。结果表明与对照组相比较,5.0 mg/(kg◦ d)组较对照及 2.5 mg/(kg◦ d)组活性氧水平明显增加(P＜0.05)。

图2 各剂量组 ROS水平占对照组的百分比

讨 论

ICP显著的生化改变是母体循环、胎儿循环及羊水高胆汁酸水平。Williamson、Gorelik和 Yang[6～8]人通过一系列研究发现,将心肌细胞暴露于高浓度牛磺胆酸(＞0.3mmo1/L)一定时间 ,新生大鼠心肌细胞出现持久性的损伤,而成年大鼠心肌细胞的损伤具有可逆性,表明胆汁酸对心脏有直接毒性作用,并提示胎儿心肌细胞较成人心肌细胞对胆酸的毒性作用更为敏感。心肌损伤或者坏死后心肌酶有不同程度的释放到血清中,其中 CK,LDH1特异性最高,检查心肌酶主要是确定心肌缺血坏死或细胞膜的通透性。

细胞的活性氧簇 (ROS)(主要为 H2O2、O2-、 OH-),不能被及时清除时,便发生氧化应激,对整个器官产生影响,若持续存在则导致细胞凋亡。目前认为 ROS的检测中线粒体是首选的、最好的方法,其出现最早。主要来源是呼吸链产生的活性氧簇,还有线粒体体膜通透性改变诱导线粒体发生的氧化应激。当各种原因导致线粒体内膜去极化,跨膜电势降低,都会使 ROS产生增加,ROS增加后,其会导致线粒体膜电位下降、开放膜通透性转换孔,细胞色素 C的释放增加,通过激活Caspase级联途径诱导细胞凋亡。

本次实验成功建立妊娠期肝内胆汁淤积模型,结果表明高 E量组的胎鼠胚胎成活率、21日胎体重均明显低于低 E量组及对照组胎鼠,高 E量组较低 E量组、对照组总胆酸与肌酸激酶同工酶显著升高。病理切片,心肌细胞中观察到明显的心肌萎缩病理结果改变,伴有心肌损害。本研究观察到高剂量组 ROS水平明显升高,由此推测,高浓度胆汁酸通过改变了心肌线粒体膜的通透性,引起了跨膜电位的降低,造成心肌损害。

综上,高浓度胆汁酸可能通过诱导心肌组织线粒体发生氧化应激,从而发挥其促进心肌细胞缺血缺氧性损伤、凋亡的毒性作用,据此推测,这可能是造成胎儿宫内猝死的原因。

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