低压低氧对大鼠 CD34与 V EGF表达的影响

西安交通大学医学院 (西安 710061)贺 学 盛业萌 刘恩岐

在高原中,大气压中氧分压降低,引起缺氧环境,从而引发高原不适症状。长期生活在高原环境中的生物,发生生理性适应和生物适应,针对低氧环境,机体建立了一系列代谢补偿机制,以更好的适应高原环境。细胞的正常代谢和生存需要氧的参与,在高原低氧环境下,机体通过增加氧的传递,加快血液循环或激活不需要氧的代谢旁路,来维持机体保持正常的生理状态[1,2]。研究发现,在高原地区,低氧环境改变了当地居民的心血管系统功能,使他们的心血管系统发生了适应性的改变。心肌正常代谢所需要的氧气和物质主要通过心肌毛细血管的运输来完成,因此,心肌毛细血管的数量严重影响心脏的代谢过程。研究证实血管内成因子 (Vascular endothelial grow thfactor,VEGF)和CD34在血管的生成中发挥着重要作用。本实验通过检测在低氧环境中大鼠心脏 VEGF和 CD34的表达变化,为揭示低氧对心肌血管生成的作用提供依据。

材料与方法

1 动物及分组 雄性健康的 Sprague-Dawley大鼠 60只,体重约为 220g,由交大医学院实验动物中心提供。随机分为四组,分别为正常组,低氧 2周组,低氧4周组,低氧 6周组。除正常组外 ,其余各组大鼠置于模拟海拔 4000m的低压氧舱内饲养,正常组与低氧组饲养的温度,湿度,光照相同。

2 主要仪器和试剂 低压氧舱(第四军医大学),核酸蛋白定量仪 (Eppendorf公司),PCR扩增仪(Takara公司 ),电泳仪、转膜等 (Bio-Rad公司),凝胶成像系统(UVP公司);引物合成(北京奥科),RNA提取、RT-PCR试剂盒(Takara公司),蛋白提取试剂盒(roche公司 ),CD34、VEGF抗体 (Santa公司 )。

3 病理学观察 取每组大鼠 5只,断头处死,剖腹取右心室,剪去心房组织,置于 4℃生理盐水中冲洗血液,然后放置在 10%的福尔马林溶液中固定 24小时以上,最后进行脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,显微镜下观察拍照。

4 CD34、V EGF mRN A表达的检测 将保存于液氮中的心肌样本置于研钵中,加入液氮进行研磨,按照 RNAi plus的试剂盒说明书进行总 RNA的提取。利用核酸蛋白定量仪检测提取的 RNA纯度,测定RNA浓度。依照反转录试剂盒说明书,取 RNA溶液1 μ l,在反转录酶作用下合成 cDNA。 然后以 cDNA为模板,对目的基因进行实时定量 PCR,检测目的基因的表达量的变化。引物序列 β-actin上游:5′-CGT TGACATCCGT AAAGACCTC-3′, 下 游:5′-T AGGAGCCAGGGCAGT AATCT-3′;CD 34上 游:5′-CCTGCCGTCTGTCAATGT T TC-3′, 下 游:5′-GCACTCCTCGGATTCCT GAAC-3′;VEGF 上 游:5′-TGTGAGCCTT GTTCAGAGCG-3′, 下 游: 5′-GACGGTGACGATGGTGGTGT-3′。 PCR条 件 为:95℃预变性 10s,95℃ 5s,60℃ 30s,40个循环。以目的基因与内参的荧光强度比值作为目的基因的相对表达量。

5 免疫印迹 (Western blot)检测 CD34、V EGF的表达 取液氮保存的心肌样本,在冰上解冻后,用剪刀剪碎,继而加入含蛋白酶抑制剂细胞裂解液,在低温下进行研磨,待研磨充分后,在冰上放置 20min,充分裂解后,在低温冷冻离心机上高速离心,12000rpm,20min,取上清,保留检测部分,其余-80℃保存。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,然后进行 SDSPAGE电泳,电压 120V,时间 2h。 Bio-Rad湿转转膜槽,200mA恒流转印 90min至 PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭 1 h,加一抗 4℃孵育过夜,加辣根过氧化酶标记二抗,室温孵育 2 h,在凝胶成像系统上显色,图像采集。

结 果

1 病理学观察:结果(图 1)显示,与正常对照组相比,低氧组大鼠心肌细变得肥大,细胞出现纤维化现象,随着低氧时间的延长,这种现象愈发明显。

2 低氧对大鼠右心室 CD34、VEGF mRNA表达的影响 (图 2):对照组、低氧 2、4、6周组心脏右心室CD34mRNA相对表达量分别为 8.3× 10-5、9.0×10-5、 9.6× 10-5、2.1× 10-4(图 2上 ),V EGF的表达量 分别为 8.1× 10-4、 1.8× 10-3、3.0× 10-3、5.5×10-3(图 2下)。可见低氧 6周组 CD34和VEGF的表达量显著的高于正常组,其中 VEGF的升高最为明显。

图1 病理学结果(A、B、C、D分别为正常、低氧 2、4、6周组)

图2 CD34、V EGF mRN A在心肌组织中的相对表达量

图3 CD34、V EGF蛋白在心肌组织中的相对表达量

3 低氧对大鼠右心室 CD34、VEGF蛋白表达水平的影响(图 3):图中从左到右对照组、低氧 2、4、6周组心脏右心室 CD34的蛋白相对表达量分别为:0.14、0.22、 0.31、0.48;VEGF的相对表达量分别为:0.18、0.27、0.39、0.56。 从数据能够得出在低氧组,CD34和VEGF的表达量都明显高于正常对照组。

讨 论

氧是维持生存的必要因素,机体进行各种新陈代谢都是在氧的参与下进行的。低大气压,低氧分压,缺氧程度大等是高原环境的特点,严重影响动植物的生存与发展,许多疾病的发生都是由于缺氧引起的。长期生活在高原低氧环境下的生物,其某些组织结构和生理机能发生了适应性的变化,以更好的适应高原低氧环境。动物对低氧环境的适应机制研究已取得一定进展,他们发现高原动物的红细胞数和血红蛋白含量明显比生活在平原地区的高;许多高原生物肺泡数目多,体积小,单位面积肺血管数目增多,从而有助于吸取更多的氧气,同时减缓肺动脉压力的升高[3];有些高原生物的血红蛋白发生突变,与氧气的结合能力更高,从而适应高原低氧环境;生物体还通过调节 NO的产生量,利用低氧诱导因子的调节等来适应低氧环境[4]。

CD34选择性地表达于造血干 /祖细胞膜上,是一种高度糖基化的跨膜蛋白,同时该因子也在血管内皮细胞及其它组织中表达。CD34在造血祖细胞表达最高,但是随着细胞分化、成熟,CD34抗体的表达逐渐减少,甚至消失[5,6]。可见 CD34与血管的生成密切相关,在新生血管中的表达十分明显。Fujimoto等研究表明,对造血干 /祖细胞进行体外培养,CD34+细胞在总细胞中所占的比例呈下降趋势[7]。宋克东等人研究发现在低氧环境培养中,CD34+细胞在总细胞中所占比例呈上升趋势,扩增倍数明显提高[8]。本实验发现,在低氧环境中,CD34在心肌中的表达明显提高,可能作为一种保护机制,促进新生血管的产生,满足心肌细胞对氧气等的需求。

作为一种细胞因子,VEGF是一种分子量为 46 KD的二聚体多肽,广泛存在于动物组织中。V EGF以内皮细胞为特异性靶细胞,能够促进血管内皮细胞的有丝分裂,增加血管通透性、降低血管张力等多种功能[9]。有研究表明,相对与正常环境,低氧能够诱导VEGF基因的表达,促进毛细血管的生成,增强血液为组织提供氧气的效率,从而提高动物对低氧环境的适应能力[10,11]。王雪莲等人的研究表明在高原低氧环境下,在低氧诱导因子作用下,VEGF的表达明显提高,通过促进新生血管的生成来适应高原环境[12]。本实验研究结果与他们的一致。由于低氧环境的作用,在大鼠心肌组织中,VEGF的表达在 mRNA水平和蛋白水平都显著增高,

综上所述,通过研究在低氧环境下 SD大鼠心肌组织中 CD34和 VEGF的表达变化,阐述了 CD34和VEGF对大鼠适应低氧条件所起的作用,为进一步揭示生物对高原低氧环境的适应机制提供参考,为探索高原缺氧的高原医学提供一定的理论依据,推动高原医学的发展。

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