冈田酸诱导SH-SY5Y细胞建立阿尔茨海默病细胞模型超微结构的变化

吴敏霞 许 盈 胡祥炬 林 曦

(福建医科大学基础医学院病理学系电镜室，福建 福州 350004)

过度磷酸化的tau蛋白可引起微管生成障碍，导致轴浆流中断，轴索运输失常，进而引起神经细胞的死亡。课题组前期的研究也证明冈田酸(OA)作用于人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞导致细胞tau蛋白过度磷酸化，与阿尔茨海默病(AD)病人脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型〔1〕。在此基础上，本实验拟从超微水平揭示AD脑中tau蛋白过度磷酸化导致的微管结构破坏与神经元退变的因果关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞 OA，Sigma公司产品，用二甲基亚砜(DMSO)配成20μmol/L的母液，分装备用。胎牛血清，杭州四季青生物工程公司产品。1640培养液，Gibco公司产品。其他试剂均为国产分析纯。SH-SY5Y细胞，福建医科大学药学院药理学系赠送。CO2培养箱，SHEL LAB公司;倒置相差显微镜，Olympic公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，待细胞间隙变得较明显，细胞突起有所回收时终止消化，RPMI1640培养液吹打成单个细胞悬液，3～4 d传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐(MTT)法 以每孔1×104细胞数接种于96孔板，96孔板内的细胞分别每孔加入10，20，40 nmol/L蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和-1抑制剂OA的1640培养液(含2.5%胎牛血清)100 μl，每种浓度4 孔，培养6，12，24，48，72 h。实验结束后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10μl，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，溶解生成的深蓝色结晶，选择波长490 nm，在BIO-RAD Model 450酶标仪测OD490 nm值，作为反映细胞代谢状况的参数。

1.2.3 光学显微镜观察 接种细胞如MTT法，然后用倒置相差显微镜进行观察、摄片。

1.2.4 超薄切片技术及电子显微镜观察 取SH-SY5Y细胞1 ×106，置尖底离心管，1 000～1 500 r/min，离心8 ～10 min，去上清，沿壁小心滴加3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定数天(或数小时)(4℃)，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗;70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm，醋酸铀、柠檬酸铅各染色5 min;在飞利浦EM 208型透射电镜下观察、摄影。

1.3 统计学分析 计量资料采用x±s表示，采用方差分析进行组间、组内显著性比较，当差别有显著性意义时再用Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。

2 结果

2.1 MTT比色法绘制细胞生长曲线 模型组20，40 nmol/L细胞活性 OD值(0.264±0.039，0.160±0.013)较对照组(0.514±0.032)显著减少(P＜0.05);而5，10 nmol/L细胞活性(0.493±0.022，0.478±0.021)与对照组无差异(P＞0.05)。表明20 nmol/L以上OA可致SH-SY5Y细胞活性显著下降，且呈剂量依赖型。

2.2 光学显微镜观察 20 nmol/L OA作用后细胞数量明显减少，细胞胞体皱缩，突起缩短消失。见图1。

2.3 电镜下观察 正常组的细胞形态正常，细胞突起处微管结构可见，OA作用于SH-SY5Y细胞后处理组细胞突起回缩，微管结构不清晰。见图2。

图1 OA作用于SH-SY5Y细胞24 h形态改变

图2 OA作用于SH-SY5Y细胞24 h微管的改变

3 讨论

AD老年性痴呆主要病理特征为神经细胞间的SP及神经细胞内神经元纤维缠结。神经元纤维缠结由双股螺旋细丝组成，每根微丝的直径为10 nm，每隔80 nm有个相互交叉点，形成典型的双股螺旋状，这种双股螺旋细丝由大量异常磷酸化的tau蛋白组成。微管是重要的细胞骨架组成，与有丝分裂，细胞内转运，细胞特性及细胞标志等多种功能有关。在神经细胞中，微管结构的完整性是神经细胞胞体与轴突间营养物质运输的基础。大量的病理临床研究也证明联合皮质中含神经元纤维缠结的神经元密度常和痴呆程度有平行关系〔2～4〕。

有关AD动物模型和细胞模型的研究一直是探索的热点。AD细胞模型是在体外进行诱导和建立，与AD动物模型相比较，具有可避免各种干扰因素，实验条件容易控制等优点。AD脑中tau蛋白被异常过度磷酸化，每克分子tau蛋白的磷酸含量由2～3 mol增高至5～9 mol，AD脑内的神经元的蛋白激酶系统和磷酸酯酶系统之间的失衡被认为是tau蛋白过度磷酸化的原因〔5〕。Dupont等〔6〕发现，OA 能使 SH-SY5Y 中胎儿 tau蛋白转变成AD样磷酸化tau蛋白。因此本课题组前期试验用OA作用于SH-SY5Y细胞，OA是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化，由此建立AD样细胞模型。但是对于OA作用后细胞超微形态及微管结构未作进一步研究，本实验在此基础上探讨AD样细胞的超微结构变化。

本研究选用OA作用于SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型，研究结果显示，随着OA作用时间的延长和浓度的逐渐增高，细胞活性逐渐下降，SH-SY5Y细胞形态发生改变较为显著，出现类似于凋亡的固缩反应。在细胞超微结构上发现，模型组细胞微管结构紊乱，突起回缩明显，可认为是OA作用后微管相关蛋白tau的过度磷酸化使得微管组装降低，微管解聚，这与文献上报道是一致的〔7〕，提示采用本研究方法建立AD模型是可行的。OA可使SH-SY5Y细胞活性降低，微管结构破坏，可作为研究AD的细胞模型。

1 许文芳，吴敏霞，谢捷明.冈田酸诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化〔J〕.福建医科大学学报，2006;40(4):361-3.

2 Cummings JL，Vinters HV，Cole GM，et al.Alzheimer's disease:etiologies pathophysiology，cognitive reserve，and treatment opportunities〔J〕.Neurology，1998;51(1-1):2-17.

3 朱粹青，曹小定.调心方药物血清对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节作用〔J〕.中国中西医结合杂志，2001;21(11):834-6.

4 Mattson MP，Guo Q，Furukawa K，et al.Presenillins，the endoplasmic reticulum，and neuronal apoptosis in Alzheimer's disease〔J〕.J Neurochem，1998;70(1):1-14.

5 Gong CX，Shaikh S，Wang JZ，et al.Phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau:decrease in Alzheimer disease brain〔J〕.JNeurochem，1995;65(2):732-8.

6 Dupont-Wallois L，Sautiere PE，Cocquerelle C，et al.Shift from fetal-type Alzheimer-type phosphorylated Tau proteins in SKNSH-SY 5Y cells treated with okadaic acid〔J〕.FEBSLett，1995;357(2):197-201.

7 Kim D，Su J，Cotman CW.Sequence of neurodegeneration and accumulation of phosphorylated tau in cultured neurons after okadaic acid treatment〔J〕.Brain Res，1999;839(2):253-62.