同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞eNOS表达及NO含量的影响

徐 倩 周晓慧 曹 凯 牛成伟 王 冰

(承德医学院,河北 承德 067000)

同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫氨基酸,为蛋氨酸循环的重要中间产物〔1〕。当Hcy代谢紊乱时,可诱导高同型半胱氨酸血症。近年来,大量研究表明,高同型半胱氨酸血症是导致动脉粥样硬化(AS)的独立的危险因素〔2〕。但是,Hcy致AS的机制目前仍不完全明确,多数研究认为,Hcy导致的氧化应激是As发生的重要环节,其中活性氧对内皮一氧化氮(NO)系统的损伤尤为重要。本研究通过观察Hcy对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)eNOS表达和NO含量的影响,探讨Hcy致AS的病理机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Hcy、四甲基噻唑氮蓝(MTT)均购自Sigma公司,DMEM培养基购自Gibco公司,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自 E.coli公司。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司。Trizol购自invitrogen公司,DEPC购自德国amresco公司。琼脂糖购自美国Uniche Co公司。NO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器 HERAcell 150型CO2孵育箱购自Heraeus公司,LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜购自Wetzlar GmbH公司,净化工作台购自上海新苗医疗器械制造有限公司,PTC-100购自MJ RESEARCH,INC,紫外可见分光光度计(DU800)购自BECKMAN COULTER公司,紫外透射反射分析仪(ZF型)购自上海嘉鹏科技有限公司。

1.3 HUVECs培养及分组 取健康剖宫产妇新生胎儿脐带,PBS液冲洗干净,用1∶1的0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰酶-0.02%EDTA(V/V=1∶1)消化13 min,收集消化液,1 000 r/min离心10 min后,弃上清,用含20%胎牛血清、10μg/L bFGF的DMEM培养基重悬,接种于25 cm2培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后换液,待细胞达到80%融合时,用0.125%胰酶-0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化传代。实验用第2代细胞,实验分组如下:正常对照组、Hcy剂量组。正常对照组细胞加含20%胎牛血清、10μg/L bFGF的DMEM培养基;Hcy剂量组细胞在上述培养基基础上再分为 4组,分别加入2.5 mmol/L Hcy(H1)、5 mmol/L Hcy(H2)、10 mmol/L Hcy(H3)、15 mmol/L Hcy(H4)。

1.4 四甲基噻唑氮蓝(MTT)法检测细胞活性 原代培养的内皮细胞达到80%融合时,用0.125%胰酶-0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化,调整细胞悬液密度为1.0×105个/ml,接种于96孔板,每孔200μl,待细胞达到80%融合时,吸弃原培养液,每孔加入无胎牛血清的DMEM培养基200μl,使细胞同步化。24 h后,按实验分组施加干预因素。每组设6个复孔。同时设只有培养液,无细胞的空白对照。继续培养24 h后,每孔加入5 mg/ml MTT 20μl,培养4 h,吸弃上清液,每孔加入二甲基亚砜150μl。振荡溶解后,用酶标仪测定在波长490nm处各孔的吸光度值。

1.5 RT-PCR检测不同浓度Hcy对HUVECs中eNOS mRNA表达的影响 将第2代 HUVECs细胞以2×105个/ml接种于24孔培养板中,每组设2个复孔。按实验分组施加干预因素后,每孔加入Trizol 300μl,提取各组细胞总RNA。按 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒进行逆转录反应,反应条件为:30℃10 min,42℃30 min,99℃5 min,5℃5min。PCR反应体系为 20 μl。eNOS上游序列为:5′CCAGCATCCCTACTCCCACCAG3′,下游序列为:5′CACCTCGGCTTCCACCTCTTG3′。β-actin上游序为:5′AGCGGGAAATCGTGCGTGAC 3′,下游序列为:5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC 3′。eNOS 反应条件为:94℃预变性2 min,94℃变性 30 s,63℃退火 30 s,72℃延伸1 min,扩增30个循环。最后10℃延伸10 min。β-actin的退火温度为58℃。取5μl PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪观察并摄取图像。eNOS mRNA相对表达强度 =eNOSmRNA扫描值/β-actin扫描值。

1.6 硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO的含量NO化学性质活泼,在体内代谢很快转为NO2-和 NO3-,而 NO2-又进一步转化为NO3-,利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-,通过显色深浅测定其浓度的高低。吸取24孔培养板中的细胞培养液,按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定,结果按下列公式计算:NO(μmol/L)= ×标准品浓度(100μmol/L)×样品测试前稀释倍数。

1.7 统计学处理 运用SPSS 11.5进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 不同浓度Hcy对HUVECs细胞生长的影响 不同浓度Hcy作用于HUVECs 24 h后,MTT结果显示,与对照组相比,同型半胱氨酸低浓度(2.5 mmol/L)对正常细胞生长的抑制作用不明显,无统计学意义,随着浓度的增高(5～15 mmol/L),同型半胱氨酸可明显抑制 HUVEC的生长(P＜0.01),见表1。

表1 不同浓度Hcy对HUVECs细胞活力的影响(x ±s,n=5)

2.2 不同浓度Hcy对HUVECs eNOS mRNA表达的影响 不同浓度Hcy作用于HUVECs 24 h后,与正常对照组比较,同型半胱氨酸低浓度(2.5 mmol/L)对eNOS mRNA影响不明显,无统计学意义(P＞0.05)。随着同型半胱氨酸浓度的增高(5～15 mmol/L),同型半胱氨酸可明显抑制eNOS mRNA的表达,eNOSmRNA的表达产物明显减少(P＜0.01),且呈现明显的剂量依赖性(P＜0.01),见表2,图1。

表2 不同浓度Hcy对HUVECs细胞eNOS mRNA表达的影响(x±s,n=5)

2.3 不同浓度Hcy对HUVECs生成NO的影响 不同浓度Hcy作用于HUVECs 24 h后,与正常对照组比较,HUVECs生成的NO减少(P＜0.01),且呈现剂量依赖性的关系(P＜0.01),见表3。

图1 Hcy对HUVECs细胞eNOSmRNA表达的影响

表3 不同浓度Hcy对HUVECs生成NO的影响(x ±s,n=5)

3 讨 论

近年来大量研究表明高同型半胱氨酸血症是造成AS的独立的危险因素,在心、脑血管疾病及外周血管硬化等疾病发病机制中起重要作用〔3〕。内皮是所有心血管危险因素共同的靶点,内皮功能异常被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病发生的始动因素,并被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病的早期表现〔4〕。高同型半胱氨酸在血管内皮细胞内过分蓄积时,有直接损伤内皮细胞的作用。NO是检测血管内皮功能的指标之一,它是内皮源性血管舒张因子,可舒张血管,抑制血管平滑肌细胞迁移、增殖和血小板聚集。NO在体内经一氧化氮合酶(NOS)催化生成,NOS有三种亚型,神经元型NOS,诱导型NOS,内皮型 NOS(endothelial NOS,eNOS)〔5〕。 在血管调节功能中起决定作用的是eNOS。NO减少或生物利用度下降可导致内皮功能障碍,使内皮依赖的血管扩张功能受损,血管收缩因子反应性增强,诱导动脉粥样硬化形成。

本实验观察了不同浓度Hcy对HUVECs细胞生长的影响,发现 Hcy剂量组(5～15 mmol/L),可明显抑制HUVECs的生长。RT-PCR结果显示,Hcy剂量组(5～15 mmol/L)与HUVECs作用24 h后,eNOS mRNA的表达明显下降,本实验结果表明Hcy处理的各剂量组HUVECs NO含量明显降低,且呈现明显的剂量依赖性。与正常对照组比较,2.5 mmol/L Hcy剂组的eNOS mRNA的表达水平无明显变化,但NO的含量明显降低,这说明NO的生成可能不仅受eNOS表达水平的影响,可能还受其他因素的影响,如eNOS失耦联,过多的活性氧可与NO发生反应〔6〕。

综上所述,Hcy可通过抑制eNOS的表达,使eNOS活性降低,减少HUVECs内NO的生成,进而损伤血管内皮,诱导动脉粥样硬化的发生和发展。因此,可以推断通过提高eNOS的表达,增加eNOS的活性,进而促进NO的生成;NO的含量增加可使损伤的血管内皮恢复功能,从而延缓和逆转AS的发生和发展,本研究结果将为AS的药物治疗提供新的治疗靶点。

1 高 娟,郭 力.同型半胱氨酸与动脉硬化〔J〕.医学研究与教育,2010;27(1):82-4.

2 耿学川,杜继臣,李继来,等.高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化的关系〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(8):82-4.

3 Garc ía-Pinilla JM,Espinosa-Caliani S,Jiménez-Navarro M,et al.Influence of 677 C→T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase on medium-term prognosisafter acute coronary syndromes〔J〕.Tex Heart Inst J,2007;34(2):142-7.

4 向 阳,加娜提,爱 华 .高同型半胱氨酸血症大鼠血浆一氧化氮和内皮素1水平的变化:血管内皮功能损伤验证〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2007;2(41):8242-6.

5 Zammiti W,Mtiraoui N,Mahjoub T.Lack of consistent association between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms,homocysteine levels and recurrent pregnancy loss in Tunisian Women〔J〕.Am JReprod Immunol,2008;59(2):139-45.

6 鲍晓梅,吴春芳,陆国平 .阿托伐他汀对同型半胱氨酸所诱导内皮祖细胞功能损伤的保护作用 〔J〕.心脏杂志,2010;22(3):332-7.