微生物利用木质纤维原料产木聚糖酶研究现状

宋红霞, 李秀婷, 孙宝国, 宋焕禄, 朱运平

木聚糖是由β-1,4糖苷键相连的木糖基构成主链的线性大分子.木聚糖结构复杂常具有复杂的侧链,它的完全降解需要多种水解酶的参与,其中β-1,4-内切木聚糖(EC.3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,是木聚糖降解中最关键的酶[1-2].木聚糖酶在食品、饲料、纸浆造纸、木质纤维原料的生物转化等领域具有重要的应用价值[1],引起了人们的广泛关注.许多研究表明[3-5],富含木聚糖的木质纤维原料可诱导木聚糖酶的产生.此类农业废弃物作诱导底物能够有效地降低酶制剂的生产成本,由此产生的木聚糖酶十分适合于工业应用.在资源日益匮乏的今天,利用廉价的农业废弃物生产高附加值的木聚糖酶具有重要的实际意义.本文着重对微生物发酵木质纤维原料生产木聚糖酶的研究现状进行综述.

1　木质纤维原料利用现状

农业生产和农产品加工过程产生大量木质纤维类农业废弃物,主要包括农作物秸杆、谷壳、果壳及甘蔗渣、醪渣等农产品加工废弃物.这些农作物废弃物占农田生物质总产量的50%以上[6],产量非常巨大.2003年我国农作物秸秆的总产量约6.5×108t,其中稻草、玉米秸秆总量达到了4.5×108t[7].目前,我国农业废弃物的利用方式比较粗放,主要是作为燃料和饲料,还有一部分被直接还田,大约2/3的农作物秸秆被燃烧、抛弃或闲置,木质纤维原料的利用效率低下.农作物秸秆直接作为燃料燃烧时热效能仅为10%[8],造成了巨大的资源浪费和环境污染;木质纤维原料作为饲料普遍存在饲用率低的问题;农业集约化发展导致化肥的大量施用,农业废弃物还田技术也被人们所忽视[6-9].我国木质纤维原料资源化率低,最根本的原因是对木质纤维原料的认识不足.

木质纤维原料的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素,除此之外,还可能含有少量的果胶、糖类、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等成分.纤维素是自然界中含量最丰富的多糖,在植物细胞壁中纤维素聚集成微纤维[10].半纤维素是指植物细胞壁除去果胶物质后的残留物能被15%氢氧化钠所提取的碱溶性多糖[10].木聚糖是半纤维素的主要成分,在被子植物中占干重的20% ～30%,在农作物中约占25%～45%[10].木质素则是一种复杂的不溶性酚类聚合物,它具有抗化学、真菌、细菌攻击能力强的特点.在植物细胞壁中,微纤维包埋于半纤维素、木质素组成的基质中,形成了一种致密的结构[1][10](见图1):半纤维素位于微纤维和木质素之间,半纤维素以非化学键与纤维素相作用,并以共价键与木质素相连.木质纤维的这种致密的结构对于维持原位纤维的结构完整性有重要作用,同时增强了植物纤维对木质纤维降解酶的抵抗能力.农作物秸秆等木质纤维原料是宝贵的可再生资源,其综合利用主要有5个方向[7-9]:能源化、肥料化、饲料化、材料化和基质化.其中基质化是指以农业废弃物为发酵底物,进行食用菌培养或微生物发酵生产酶制剂等高附加值产品.利用农业废弃物产木聚糖酶的报道很多,麸皮[11]、麦秆[12]、玉米芯[13]、玉米秸[14]、稻秆[15]、稻壳[16]、高粱杆[17]、甘蔗渣[18]是常见的木聚糖酶诱导物,橘皮[19]、酒糟[20]、葡萄渣[21]等农业加工废弃物以及非饲料型杂草[4]等也可以诱导微生物产木聚糖酶.

2　微生物木聚糖酶的产生

图1　木质纤维的组成示意Fig.1　Woodfiber composition

微生物木聚糖酶多为诱导酶,多种木聚糖是良好的诱导物,除此之外,木寡糖、木糖和木质纤维素残基也是常见的诱导物,但诱导效果多样[22].随着国内外对木聚糖酶的研究的深入,许多能利用农业废弃物产木聚糖酶的微生物得到了分离,主要生产菌是嗜热棉毛菌[13][17]、木霉[23]、曲霉[19]、青霉[12][20]、链霉菌[16]和芽孢杆菌[11].目前诱导微生物产木聚糖酶的机制尚未完全明了.Kulkarni[24]描述了木聚糖诱导微生物细胞产木聚糖酶的过程:木聚糖是一种大分子聚合物,不能直接穿过细胞壁,只有降解为小分子片段后才能进入细胞内,进而诱导木聚糖酶产生.在微生物生长过程中,首先分泌出少量组成型木聚糖酶,作用于细胞外的木聚糖产生长度不一的低聚木糖,然后这些低聚木糖在细胞透过酶的作用下进入细胞,诱导木聚糖酶基因开始合成并分泌一些木聚糖降解酶到细胞外.这些酶主要包括:内切木聚糖酶、木糖苷酶、转糖苷酶,它们一方面继续降解木聚糖产生低聚木糖,另一方面降解低聚木糖为二糖.而这些二糖经细胞膜上转移酶作用进入细胞内诱导产生第二阶段的木聚糖酶.

表1　几种农业废弃物的成分分析Tab.1　Analysis of components of several agricultural wastes

相对于纯木聚糖而言,农业废弃物诱导产酶的过程更为复杂,具体的机理尚不清楚.许多研究表明,麸皮能够诱导多种微生物产生大量的木聚糖酶[11][30-31],而稻壳[32]、甘蔗渣[33]的诱导效果则相对较差.麸皮的化学成分分析(见表1)表明麸皮中含10% ～14%的可溶性糖,其中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖分别占42.5%,15.4%,3.1%和2.7%,在发酵前期这些糖分促进了微生物生长和增殖[30],另外这些单糖本身也可能具有诱导作用[22];麸皮含有36%的半纤维素和超过10%的粗蛋白氮,大量木聚糖的存在充分地诱导了木聚糖酶的产生,而有机氮对木聚糖酶蛋白的形成具有重要的作用[30][34].同时由于麸皮中的木质素含量低,麸皮表面结构比较疏松,有利于营养成分的释放以及木聚糖酶与底物的接触.稻壳和甘蔗渣中的半纤维素含量小于20%,木质化程度较高(见表1),木质纤维表面比较致密,不利于微生物对木聚糖的利用,这可能是其诱导效果差的原因[30].将较难利用的农业废弃物与麸皮复合,来诱导微生物产酶,因各种营养成分发挥了协同作用,也会进一步提高产酶能力.A.oryzae FS018[35]可以利用多种农业废弃物产生木聚糖酶,当用麸皮与玉米芯进行复合时,产酶水平明显高于单一碳源.麸皮中纤维素、木素含量低,质地较软,木聚糖酶与半纤维素的可能较易接近,同时麸皮营养丰富,易被菌体利用.玉米芯中半纤维素含量较高,其中大量的木聚糖能对菌株产酶起到良好的诱导作用,但由于玉米芯质地较硬,有效成分可能不易被菌体利用.当选用复合碳源时营养丰富的麸皮作为主要碳源,促进菌体生长,而玉米芯中丰富的木聚糖,可在菌体生长旺盛的条件下诱导木聚糖酶的大量产生[35].

根据上述分析，现阶段分布式储能项目的经济性主要影响因素包括：项目投资成本、当地峰谷电价差、峰谷平时段、电池寿命、储能充放电方式、企业用电量、生产运行状况和电池梯级利用及回收成本等。据统计数据显示，广东省、江苏省、上海市等峰谷电价差较大的地区（一般电价差大于0.75元/kWh），储能项目已具有经济性，部分地区已建设较大规模的储能示范项目[6]。

不同木质纤维原料的诱导效果差异很大,引起这种差异的原因可能是:1)不同诱导底物中木聚糖的组成结构差异性,例如麸皮木聚糖的阿拉伯取代基较多[26],可能影响了酶与底物的识别及结合[1].2)农业废弃物成分复杂,存在的其他的营养成分如可溶性糖可能对木聚糖酶的产生具有促进或抑制作用[22].3)不同农业废弃物颗粒的表面性质、致密程度不同,木聚糖酶与木聚糖接触以及营养成分的释放难易程度不同[30].4)木质纤维的降解、木聚糖的暴露需要多种酶的参与,微生物所产生的降解酶系可能存在差异.对同一种微生物来说,不同底物的可降解性能也有所不同.

3　利用木质纤维素原料所产木聚糖酶的概况

微生物发酵生产木聚糖主要采用两种方式:固体发酵和液体发酵.液体深层发酵是一项成熟的技术,可以精确地控制通气、pH、温度等参数,方便地进行发酵产酶条件的优化.采用摇瓶发酵、小型发酵罐发酵农业废弃物生产木聚糖酶的报道非常多[4][11][16][20][36].许多研究发现液体发酵的放大比较困难,从250 mL摇瓶培养放大至5 L发酵罐,Kumar等[36]发现Thermomyces lanuginosus MC 134的产酶量由3 299 U/mL降至2 009 U/mL.木聚糖酶生产从实验室水平到实现工业化生产需大量的投入.固体发酵是一种环境友好、低成本的发酵技术.微生物在潮湿的几乎没有自由水的培养基上生长代谢,因此固体发酵方式更接近微生物自然生长环境,是生产酶类和次级代谢物包括木聚糖酶的有效方法[12][30].富含木聚糖酶的廉价的农业废弃物非常适合作为固体发酵的底物生产木聚糖酶,固体发酵方式在丝状真菌中更为常见.丝状真菌能在水分含量较低条件下生长,其菌丝能攀附在木质纤维原料表面生长,并渗透到基质内,与其他单细胞的细菌及酵母菌相比,更适合固体发酵.以棕榈纤维为固体发酵底物,土曲霉A.terreus MTCC 8661[37]分泌了高达115 000 U/gds的胞外木聚糖酶.引人注意的是,近来报道了两种细菌 B.pumilus[30]、Burkholderia sp.[38],它们固体发酵麸皮产木聚糖酶水平分别达到了25 431 U/gds和5 200～5 600 U/gds.但是固体发酵具有传热传质不均匀,发酵参数不容易控制,不容易机械化操作等缺点,限制了其大规模的应用[3].

微生物诱导产木聚糖酶的机理尚不明确,Dwivedi认为诱导底物木聚糖的高度不均一性是产生同工酶的诱因[4].Chandra R的研究发现,Aspergillus fumigatus AR1在酸性条件下利用木聚糖诱导时仅产生一种木聚糖酶,在碱性条件木糖诱导时则产生了至少四条木聚糖酶带[39].不同的诱导底物以及培养条件都可能对不同种类木聚糖酶的合成发挥作用.木聚糖酶同工酶可能是由不同的基因翻译而来[40],也可能是同一个基因的不同等位基因翻译的产物[41];m-RNA前加工、蛋白多肽翻译后加工等也可能导致同工酶的出现[42].这些同工酶的性质比较相似,而这种复杂的木聚糖酶酶系,增加了木聚糖酶的纯化难度.农业废弃物诱导木聚糖酶时经常伴随其他木质纤维降解酶类的产生,在真菌中尤为明显,例如 A.fumigatus fresenius[15]、A.oryzae 3.042[43]所产纤维素酶相对酶活均超过木聚糖酶的10%,过高的纤维素酶限制了木聚糖酶在纸浆生物助漂中的应用,并增加了纯化难度.关于酵母及大型食用真菌产木聚糖酶的研究也有报道[3][18],此类微生物安全性方面具有优势,但总体来说这种来源的木聚糖酶产量一般较低.

农业废弃物诱导真菌产生木聚糖酶的现象比较普遍,总体而言,真菌产酶水平相对较高.以高粱杆和玉米芯分别诱导 Thermomyces lanuginosus D2W3[17]和 Aspergillus foetidus MTCC 4898[44]进行固体发酵产酶水平分别达到了48 000 U/gds和3 065 U/gds.嗜热棉毛菌Thermomyces lanuginosus是一种高产木聚糖酶的嗜热丝状真菌,玉米芯能够诱导Thermomyces lanuginosus SSBP[13]、 Thermomyces lanuginosus MC 134[36]和Thermomyces lanuginosus SDYKY-1[45]产生超过3 000 U/mL的木聚糖酶.嗜热拟青霉Paecilomyces themophila J18以5.0%的玉米芯粉为碳源和诱导底物,发酵5天后产酶水平达到了1 276 U/mL[46].以麦秆为诱导底物进行固体发酵Paecilomycesthemophila J18[12]产生了18 580 U/gds的木聚糖酶.Thermomyces lanuginosus SDYKY-1和Paecilomyces themophila J18是国内利用木质纤维原料发酵产木聚糖酶的高产菌.真菌木聚糖酶的最适pH一般在5.0～7.0,分子量多在21 KDa～25 KDa之间[19][47-48],少数微生物能释放高分子量的木聚糖酶[4][39][49].大多数真菌木聚糖酶的耐热性能一般,耐热性能好的木聚糖酶仅见于Thermomyces lanuginosus[13][50]、Paecilomyces themophila[51]、Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]木聚糖酶.Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]所产木聚糖酶的最适pH为9.0,在pH10.0,70℃保温2小时相对酶活力超过60%,这在真菌木聚糖酶中是比较少见的.酶谱分析表明该菌株共产生121 KDa,77 KDa两种分子量的木聚糖酶.许多微生物能同时产生两种或两种以上的木聚糖酶,例如Aspergillus fumigatus AR1[39]、Streptomyces actuosus A-151[16]等.

细菌木聚糖酶主要来源于芽孢杆菌.许多芽孢杆菌木聚糖酶在耐碱、耐高温方面具有优势,但大多数芽孢杆菌产酶量较低[3],不能满足实际应用.近年来一些高产木聚糖酶的芽孢杆菌得到了分离:Bacillus pumilus MK001[11]和Bacillus pumilus ASH[52]分别以麸皮为诱导底物,液体发酵产酶水平高达2 886 U/mL和5 407 U/mL;而Asha P[30]等筛选到一株碱性耐热短小芽孢杆菌,该菌株以麸皮为发酵底物,采用固体发酵的方式产生了25 431 U/gds的胞外木聚糖酶.短小芽孢杆菌Bacillus pumilus A-30在15 L发酵罐中发酵3天产酶水平为400 U/mL[53].多数芽孢杆菌木聚糖酶的最适pH在6.0～9.0之间,最适温度在55～80℃,并且这些细菌很少产生纤维素酶[38][52-53],因此这些酶在纸浆造纸领域展现了良好的应用前景.农业废弃物诱导放线菌产木聚糖酶的报道则相对较少,仅见于链霉菌.Streptomyces cyaneus SN32[54]和Streptomyces olivaceoviridis E-86[55]是已报道的可利用农业废弃物的木聚糖酶高产菌:产酶水平分别达716 U/mL和1 385 U/mL.放线菌所产木聚糖酶一般不伴随产生纤维素酶,分子量集中在20～25 kDa或30～55 kDa;链霉菌木聚糖酶的最适pH值和pH值稳定性分别为pH 5.5～7.0和pH 5.0～9.0之间,最适温度和温度稳定性分别集中于65～80℃和50～70℃[16][54-55].与真菌木聚糖酶相比,链霉菌木聚糖酶在耐热和耐碱性上具有一定的优势.

获得一株出发菌株后,可以通过人工诱变、优化发酵条件提高产酶能力.虽然诱变后的菌株存在回复突变的问题,仍有不少研究者通过人工诱变提高了微生物的产木聚糖酶能力,例如 Thermomyces lanuginosus SK[36]和 Penicillium oxalicum SA-8ITCC6024[4]经物理化学诱变后产酶能力分别提高了1.5和1.87倍.

4　利用木质纤维素原料产木聚糖酶存在的问题及展望

木聚糖酶实现工业应用需满足生产成本低、催化活性高、对pH和温度的稳定性好、贮存稳定等要求.虽然对木聚糖酶的研究越来越深入,但目前多数木聚糖酶的研究及应用仅存在于实验室水平,仅有少数木聚糖酶的生产实现了工业化.其主要原因是:多数微生物所产的木聚糖酶产量较低,不能满足实际应用;微生物利用农业废弃物产酶的机制尚未明了,微生物发酵生产木聚糖酶的放大比较困难;农业废弃物发酵后的粗酶液中,除了木聚糖酶外还含有其他的酶类甚至是毒素,导致在很多领域直接使用粗酶液无法实现,而后续的木聚糖酶的纯化成本太高;目前多数木聚糖酶在耐酸、耐碱、耐高温方面性能不足;国内多数研究工作仅着眼于木聚糖酶的产量,对木聚糖酶的特性未能深入研究,木聚糖酶应用特点的探讨也不够深入.

目前已商业化木聚糖酶的数量不多[3],并且这些酶的最适的作用温度和pH还难以满足实际生产中对不同特性木聚糖酶的需要.我国拥有丰富的廉价木质纤维原料,直接利用农业废弃物发酵产酶,将大大节省木聚糖酶的生产成本,用农业废弃物代替木聚糖作为木聚糖酶的诱导底物是大势所趋.性能优良的木聚糖酶生产菌是木聚糖酶实现工业应用的基础,因此今后的研究应加强可利用农业废弃物产木聚糖酶的菌种筛选和酶应用特点的探讨.我国的微生物资源十分丰富,结合实际应用的需求筛选低成本的不同特性的木聚糖酶生产菌株,深入研究其产酶的机理和过程,为木聚糖酶的实际应用提供菌种基础及理论数据,更好地控制微生物产酶及扩大生产过程,使木聚糖酶在我国各个应用领域均能发挥巨大作用.