不同剂量乌司他丁对脂多糖致急性肺损伤新生大鼠MMP-2表达的影响

王娟娟，杨莉

(东南大学医学院，江苏南京 210009)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指机体在遭受非心源性的各种致病因素后发生的急性炎症反应，其主要病理变化是急性弥漫性肺泡上皮细胞及肺泡毛细血管内皮细胞损伤。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)又称明胶酶A，可降解Ⅳ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白等肺泡基底膜的重要组成部分，正常情况下参与肺组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的动态平衡。ALI时MMP-2表达增加，可导致ECM降解，破坏肺泡-基底膜屏障功能，导致肺出血、渗出及水肿等病理改变。乌司他丁(ulinastatin，UTI)又称尿胰蛋白酶抑制剂［1］，具有抗炎、抗氧化、稳定溶酶体膜等作用。本实验拟观察乌司他丁对急性肺损伤新生大鼠MMP-2表达的影响，并分析其对肺组织的保护作用及有无剂量依赖性，为临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物、试剂及仪器

7日龄清洁级SD新生大鼠40只(由东南大学医学院实验动物中心提供)，体质量15.0～20.0 g，雌雄不限。大肠杆菌LPS(Sigma公司，血清型055:B5)，乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司)，兔抗大鼠单克隆抗体(福州迈新生物科技有限公司)，PCR试剂盒(南京凯基生物公司)，Olympus光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 动物分组及模型制备

40只实验鼠随机分为生理盐水对照组(A组)、急性肺损伤模型组(B组)、UTI小剂量组(C组)、UTI中剂量组(D组)和UTI大剂量组(E组)，每组8只。B、C、D、E 组予以5 mg·kg－1LPS腹腔注射建立急性肺损伤模型［2］，同时 C、D、E 组予以 2.5 万 U·kg－1、5.0 万U·kg－1［3］、10.0 万 U·kg－1［4］UTI腹腔注射。

1.3 新生大鼠肺组织病理学观察

1.3.1 HE染色 给药后4 h，取左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，石蜡包埋，5 μm切片，常规 HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.3.2 免疫组化染色 免疫组化染色按标准程序操作。以组织内出现棕色颗粒为阳性表达，每例随机观察3个视野，图像采用真彩色医学图像分析系统(Media Cybernetics公司 Image-Pro Plus 6.0)测定其光密度值，再取其平均值作为该组光密度。

1.3.3 RT-PCR观察肺组织中的MMP-2的基因表达

Trizol一步法提取肺组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，得到cDNA。在PCR仪中反应:Taq 酶 0.5 μl，PCR buffer(含镁离子)5 μl，dNTP 1 μl，10 μmol·L－1的上下游引物各 2 μl，RT 产物 2 μl，用双蒸水补足体系至50 μl。MMP-2(320 bp)上游引物5'-CTGAAGAGCGTGAAGGTTGGA-3'，下游引物5'-AAGGATGTGGAGGGAGATGAGT-3'，退火温度72℃，34个循环。actin(527 bp)上游引物5'-CTACAATGAG CTGCGTGTGG-3'，下游引物5'-CGTGAGAAGGTCGGA AGGAA-3'。反应结束后取PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳，经凝胶成像分析电泳条带。以目的基因与内参基因条带的光密度比值为其表达的相对量，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据采用±s表示，组间比较行方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 新生大鼠肺组织HE染色

光镜下观察:A组新生大鼠肺组织结构无明显损伤，肺泡结构完整，肺泡结构无明显水肿及炎症等改变(图1A);B组肺组织结构损伤明显，弥漫性充血水肿、渗出，肺间质增宽，炎症细胞浸润(图1B)，示模型复制成功;乌司他丁干预组肺组织出血、渗出及间质增宽程度较模型组减轻(图1C、D、E)。

2.2 新生大鼠肺组织免疫组化染色

MMP-2阳性表达于胞浆中。A组呈弱阳性表达，为淡棕色。B组MMP-2表达增强，主要在气道上皮细胞、肺泡上皮细胞及内皮细胞内。乌司他丁干预组与模型组比较表达降低，且随乌司他丁剂量增加，MMP-2表达逐渐降低，中剂量组、大剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2、表1。

图1 新生大鼠肺组织切片 HE×200

图2 肺组织MMP-2免疫组化结果 ×400

表1 新生大鼠肺组织MMP-2免疫组化染色结果±s)

表1 新生大鼠肺组织MMP-2免疫组化染色结果±s)

与急性肺损伤模型组比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01

组 别 n MMP-2 OD 值生理盐水对照组 8 0.082 ±0.016a急性肺损伤模型组 8 0.203 ±0.074乌司他丁小剂量组 8 0.187 ±0.027乌司他丁中剂量组 8 0.163 ±0.015b乌司他丁大剂量组 8 0.134 ±0.018b

2.3 肺组织MMP-2 mRNA表达

MMP-2 mRNA在A组有少量表达，在B组表达较A组明显增强(P＜0.01);乌司他丁干预后MMP-2 mRNA表达减少，随药物剂量的增加呈现降低趋势，中剂量组、大剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P ＜0.05或 P ＜0.01)，见表2。

3 讨 论

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是存在于细胞之间的动态网状结构，是肺泡-毛细血管屏障的主要结构骨架。正常生理条件下，MMPs参与ECM的动态平衡，与TIMPs之间的平衡是保持ECM完整性的前提条件［5］。基质金属蛋白酶-2又称明胶酶A，是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族成员。杨宁等［6］报道，新生儿血浆MMP-2水平与ALI病情成正相关。ALI时肺内多种细胞可合成TGF-β、TNF-α等细胞因子，这些细胞因子可介导多种细胞表达MMP-2，促使MMP-2生成增多，造成MMP-2/TIMPs比例失衡［7］，导致肺组织内ECM的大量降解，从而破坏肺泡-毛细血管屏障功能，增加毛细血管内皮的通透性，引发肺水肿［8］，富含蛋白的水肿液使肺表面活性物质稀释、失活，最终导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的发生。Steinberg等［9］报道，急性肺损伤时，MMP-2增高是一个特异性肺部反应，独立于另外器官的损伤。张向峰等［10］探讨高氧所致ALI的机制时发现，MMP-2/TIMP-2比例失衡可造成肺泡-毛细血管屏障损伤，在导致肺水肿的过程中起重要作用。此外，本实验利用新生大鼠腹腔注射5 mg·kg－1LPS建立新生儿急性肺损伤模型，与生理盐水对照组比较，急性肺损伤模型组新生大鼠注射LPS后肺组织中MMP-2蛋白及mRNA表达增加，导致肺出血、渗出及间质增宽水肿，ECM结构破坏，组织细胞排列发生紊乱，差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1、2)，肺组织病理学改变符合急性肺损伤的病理特点［11］。

表2 新生大鼠肺组织MMP-2 mRNA RT-PCR OD值±s)

表2 新生大鼠肺组织MMP-2 mRNA RT-PCR OD值±s)

与急性肺损伤模型组比较，a P ＜0.01，b P ＜0.05

组 别 n OD(MMP-2 mRNA)生理盐水对照组 8 0.588 ±0.074a急性肺损伤模型组 8 0.966 ±0.068乌司他丁小剂量组 8 0.911 ±0.051乌司他丁中剂量组 8 0.854 ±0.048b乌司他丁大剂量组 8 0.652 ±0.056a

广泛严重的肺泡损害和肺水肿是急性肺损伤的典型病理改变，能否有效清除肺泡内过多的液体，维持肺泡腔相对干燥的环境，对于进行有效的气体交换有非常重要的意义。翁翠莲等［12］以美洛昔康干预内毒素性急性肺损伤时，肺组织MMP-2 mRNA的表达显著降低，进而减轻肺水肿、出血和炎症浸润等，说明下调MMP-2的表达能够使减少胶原蛋白的降解，缓解肺泡-毛细血管基底膜的损伤，从而减缓ALI/ARDS病程进展。Inoue等［13］以UTI基因缺陷型大鼠制作LPS急性肺损伤模型发现，给予LPS后UTI基因缺陷型大鼠肺部水肿及炎症浸润情况较野生型严重，其血清及肺组织中的促炎因子、炎症因子及细胞黏附分子-1(ICAM-1)等表达水平均比野生型显著增高，说明乌司他丁可以通过抑制细胞因子的生成保护由内毒素引起的ALI。何岱昆等［14］以光气吸入性肺损伤大鼠作为研究对象，证实乌司他丁可以通过抑制明胶酶的表达对肺脏起到保护作用，与糖皮质激素保护作用相似。刘长海等［15］的研究亦证实，乌司他丁能够通过抑制MMP-2在肾组织中的表达，调节MMP-2/TIMP-2的平衡，减轻肾小球屏障的破坏，从而发挥对肾脏的保护作用。

本实验给予乌司他丁干预新生大鼠ALI模型后，光镜下观察肺组织病理切片，C、D、E组的肺出血、间质水肿及渗出情况均较模型组减轻，E组变化最显著，提示乌司他丁对脂多糖急性肺损伤有保护作用。本实验研究亦发现，新生大鼠肺组织中MMP-2 mRNA及蛋白表达较降低，中剂量及大剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);同时给予乌司他丁干预后肺泡周围的ECM出现，组织排列逐渐稳定有序。本实验急性肺损伤模型组气道上皮细胞、肺泡上皮细胞及内皮细胞内MMP-2均显著表达;而予以乌司他丁干预后MMP-2表达明显减弱;中剂量组、大剂量组均优于小剂量组，提示乌司他丁对MMP-2的表达有良好的抑制作用，且其抑制作用呈现剂量依赖性。因此，乌司他丁能通过抑制MMP-2的表达而对急性肺损伤起到有效的保护作用。

综上所述，乌司他丁对LPS致急性肺损伤新生大鼠有保护作用，这种作用可能与抑制MMP-2的表达有关，但乌司他丁对LPS致ALI的保护作用是直接或间接抑制MMP-2的表达尚不清楚，其作用机制有待进一步证实。

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