内毒素休克大鼠血清中TNF-α、皮质醇、LPS 的测定及肾上腺的病理改变

孙佳，夏海鸣

(1.东南大学医学院 传染科，江苏南京 210009;2.东南大学附属第二医院，江苏南京 210003;3.东南大学医学院 内科学，江苏南京 210009)

感染性休克是各种感染性病原体尤其是革兰阴性菌感染引起的全身炎症反应综合征并发组织灌注不足及多器官功能障碍综合征［1］，是ICU病死率最高的疾病［2］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌的细胞壁成分，亦称内毒素，是主要的毒力因子。内毒素进入机体后，刺激血液及组织中单核-巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等靶细胞释放多种细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IFN-γ，其中 TNF-α 是最早产生、最重要的炎症因子［3］。这些炎症因子的产生原本是机体的一种防御性反应，有利于清除病原菌，但若反应过度，则可引起难以控制的“瀑布式炎症级联反应”，导致感染性休克、全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭，甚至死亡。休克发生时，各器官功能与休克这一病理生理过程之间存在相互作用的关系，其中肾上腺的皮质部分由于具有分泌糖皮质激素的功能而与感染性休克的发生、发展密切相关。休克作为一种全身微循环障碍性疾病，再加上内毒素及细胞因子的损伤，从理论上讲也应该会出现肾上腺皮质结构和功能的损伤。本研究通过建立内毒素休克大鼠模型，检测处于稳定休克状态的大鼠血清中的TNF-α、皮质醇和LPS浓度，以及肾上腺组织中的LPS浓度，并在光镜下观察肾上腺结构的损伤，以期对内毒素休克有进一步的认识，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性清洁级 Wistar大鼠 40只，体质量(200±20)g，购自中国科学院上海实验动物中心上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证2007000502402。

1.2 试剂和仪器

LPS(E Coli O111:B4)购自Sigma-Aldrich公司，D-氨基半乳糖(D-GalN)，大鼠TNF-αELISA试剂盒(南京凯基生物有限公司)，大鼠LPS ELISA试剂盒(南京凯基生物有限公司)，戊巴比妥钠，罗氏Elecsys1010电化学发光全自动免疫分析仪，手术器械，动物实验操作台，BL-410生理仪，压力变换器，台式电脑，PE50管，医用三通管，肝素生理盐水，生理盐水，玻璃匀浆器。

1.3 内毒素休克大鼠模型的制备和分组

40只大鼠随机分为正常对照组(n=10)和内毒素休克组(n=30)。戊巴比妥钠、D-GalN、LPS均溶于0.9%氯化钠注射液，所用器皿均经灭菌处理。大鼠于实验前12 h禁食，自由饮水。各组大鼠先予2%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰卧于动物手术台，固定四肢，分离右颈总动脉，插PE50管(实验前准备PE50管，连接压力变换器，BL-410生理仪，三通管与PE50管内用肝素生理盐水充盈，无气泡)。BL-410生理仪观察并记录平均动脉压(MAP)和心率变化。内毒素休克组于腹腔内注射500 mg·kg-1D-GalN，30 min后尾静脉注射25 mg·kg-1LPS，持续注射5 min，注射完内毒素后再注射0.2 ml生理盐水，以确保内毒素完全进入体内，观察大鼠血压和心率的变化，以注射LPS后血压下降至8.0 kPa(60 mmHg)以下并持续6 h不死亡作为成功休克模型的标准［4］。

1.4 血液标本的留取及指标检测

将正常对照组和内毒素休克组中符合休克标准的大鼠放血处死，取7 ml血液置于离心机中以1 500 r·min-1离心10 min，吸取上清，分装成3个小管，置-80℃冰箱待测。血清标本收集齐后，ELISA法检测血清中TNF-α和LPS浓度，操作方法严格按试剂盒说明书进行;电化学放光免疫分析法测定血清中皮质醇浓度。

1.5 肾上腺标本的留取、LPS检测及病理学观察

大鼠处死后即刻取双侧肾上腺，其中一侧放入-80℃冰箱，待收集齐后匀浆，检测LPS浓度;另一侧放入10%甲醛溶液中固定，收集齐后常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察组织形态学变化。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠MAP的变化及休克持续时间的观察

腹腔注射D-GalN后，MAP即刻小幅度下降，10 min内回升至正常。于注射D-GalN后30 min尾静脉注射LPS，MAP迅速大幅度下降，30 min内回升至正常(考虑为应激性反应)，并维持30 min左右，而后逐渐缓慢下降并维持较低水平。其中19只大鼠符合休克标准，即注射LPS后血压下降至8.0 kPa(60 mmHg)以下并持续6 h不死亡。

2.2 两组大鼠血清及组织中相关指标的检测

正常对照组大鼠血清TNF-α、皮质醇、LPS浓度以及肾上腺组织中LPS浓度均处于较低水平，而内毒素休克组大鼠血清和组织的相应指标则明显升高(P＜0.01)，见表1。

表1 两组大鼠血清TNF-α、皮质醇、LPS质量浓度以及肾上腺组织中LPS质量浓度的比较±s)

表1 两组大鼠血清TNF-α、皮质醇、LPS质量浓度以及肾上腺组织中LPS质量浓度的比较±s)

与对照组比较，a P ＜0.01

组 别 ρ(血清 TNF-α)/(ng·L-1) ρ(血清皮质醇)/(μg·L-1) ρ(血清 LPS)/(μg·L-1) ρ(肾上腺 LPS)/(μg·L-1)正常对照组 366.34 ±42.66 4.96 ±0.65 14.63 ±2.87 8.64 ±1.90内毒素休克组 842.41 ±86.12a 9.50 ±1.35a 231.44 ±18.75a 154.23 ±24.63a

2.3 两组大鼠肾上腺病理切片的比较

将两组大鼠的肾上腺组织做成病理切片，HE染色，光镜下观察的结果显示:正常对照组(图1A)大鼠的肾上腺皮质束状带未见明显病变，而内毒素休克组大鼠的肾上腺皮质束状带有些部位出现明显的充血(图1B)，有些部位出现明显的水肿(图1C)，还有些部位同时出现充血和水肿(图1D)。

图1 两组大鼠肾上腺皮质束状带(HE染色 ×200)

3 讨 论

内毒素休克是一个以急性微循环障碍为主的临床综合征，主要特征是体内重要脏器的低灌注状态，使机体细胞无法维持正常的营养代谢和功能，临床表现为低血压、血管损伤、弥漫性血管内凝血，最终导致多脏器功能衰竭，使休克难以逆转［5］。感染性休克的病理生理机制与失控性炎症级联反应有关，并不是细菌或内毒素直接作用的结果［6］。经典的内毒素休克模型的复制方法是一次性静脉注射大量内毒素，造成严重的内毒素血症，但由于损害严重，动物在较短时间内不可逆地迅速死亡，不能准确地体现细菌性感染的发病过程。因此，实验大多采用二次打击或D-GalN致敏法控制内毒素休克程度，但所用D-GalN和LPS的剂量并不固定，需根据不同情况摸索［7］。此外，LPS的因细菌血清型及提纯方法的不同，有数十种型号，进一步导致LPS休克剂量差异加大。本实验测定了酚萃取法提纯的大肠杆菌O55:B5的LPS所致内毒素休克大鼠血中LPS及肾上腺组织中的LPS浓度，即当血液中LPS剂量达到此数值时会导致大鼠休克。造模动物种属不一，模型认定标准也不一，但多以血流动力学改变为主要判断指标［6］。

内毒素休克、出血性休克、外伤性休克中均表现TNF-α的增高，但程度不同，前者较后两者增高更为显著［8］。TNF-α是内毒素进人体后诱导机体效应细胞产生炎症反应最主要的炎症因子之一，被认为是全身炎症反应的始动介质，在内毒素休克过程中扮演重要角色［9］。TNF-α与IL-l可进一步引起炎症因子IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IFN-γ，及其他脂质介素如血栓素、白三烯、血小板活化因子、前列腺素、补体等的释放，进一步放大炎症反应［10］。此外，TNF-α也是导致休克低血压的重要因素，其机制包括:(1)诱导单核-巨噬细胞大量表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，导致巨噬细胞过量释放NO，同时诱导血管内皮细胞释放大量的NO［11］，造成全身血管舒张反应，引起持续的低血压和多器官功能衰竭［12］。(2)直接导致内皮细胞功能减退，增加血管通透性，降低循环阻力［13］。(3)感染性休克时心脏组织受LPS刺激也会生成TNF-α，心脏还可以表达TNF-αⅠ型和Ⅱ型受体。TNF-α发挥作用的前提是与TNF-αⅠ型或Ⅱ型受体结合。TNF-α的负性收缩作用主要由Ⅰ型受体介导的［14］。

内毒素休克作为一种全身微循环障碍性疾病，会造成全身脏器的损害，因此从理论上讲也应该会出现肾上腺皮质的损伤。休克过程中，微血管经历痉挛、扩张和麻痹3个阶段，亦即微循环的变化包括缺血缺氧期、淤血缺氧期和弥散性血管内凝血(DIC)期3个阶段。在DIC期，体内凝血与抗凝的平衡遭到破坏。早期血管内发生凝血时，大量血小板和凝血因子被消耗，导致高凝状态转变为低凝状态。另外，体内的继发性纤维蛋白溶解产生大量纤溶酶，使纤维蛋白原裂解为X和A、B、C裂片，再进一步裂解为Y、D、E裂片。这些因素导致了DIC晚期的广泛出血，包括皮肤、黏膜或内脏。微循环障碍在休克的发生中固然重要，但细胞的损伤可发生在血流动力学改变之前，亦即细胞的代谢障碍可为原发性。内毒素引起的细胞损伤最早出现在胞膜，内毒素可通过激活膜磷脂酶A2(PLA2)使溶血卵磷脂产生增多，导致膜磷脂降解并诱发产生自由基，抑制细胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性，导致细胞内 Na+增多、K+降低，细胞出现水肿［15］。

内毒素休克时，多种炎症介质释放增多可激活HPA轴，使循环血液中肾上腺皮质激素水平升高。这是机体对应激的防御反应，有利于机体动员能量和保持内环境的稳定，若HPA轴应激反应过程太长或刺激太强，会导致能量过度消耗和内分泌系统功能紊乱，表现为相对性肾上腺皮质功能不全，使内毒素休克向多器官功能不全综合征方向发展，最终导致患者死亡［16］。糖皮质激素(glucocorticoid，GC)，主要为皮质醇，因其强大的抗炎特性也被广泛应用于治疗各种炎性疾病，它能够干扰众多细胞因子介导的炎症通路［17］。Toll样受体家族(TLRs)是介导各类先天或后天免疫反应的受体家族之一，其中TLR4作为介导内毒素产生作用的重要受体，被认为是启动这一炎症级联反应的阀门［18］。GC的抗炎作用即涉及调控 TLR信号途径，GC可抑制内毒素性休克大鼠TLR的表达，但作用机制尚不明确［19］:一些细胞因子如TNF-α可刺激TLR表达增加，而TLR是表达增加又促进了细胞因子的产生，形成一个“正反馈环”，GC是直接抑制TLR表达还是作用于此“正反馈环”，有待于进一步研究。另外，关于GC在感染性休克中应用的安全性和有效性的研究虽然已进行了半个世纪，但至今仍存在争议［20］。目前较主流的GC的应用方法是小剂量的皮质醇。Buchele等发现小剂量皮质醇可改善感染性休克病人的微循环［21］，而且小剂量的GC能增加而不是抑制感染性休克病人的先天免疫力［22］。通过调节肾上腺皮质的功能状态可能是内毒素休克治疗的新途径，深入了解内毒素休克时的皮质醇分泌及其肾上腺皮质的损伤机制可望为内毒素休克等危重患者的治疗提供新思路。

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