瘦素对大鼠脂肪细胞SOCS-3表达的影响

刘莉，顾海伦，赵越，任亚浩，于飞，杨军

(1.中国医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，辽宁沈阳 110001;2.中国医科大学附属盛京医院骨外科，辽宁沈阳 110004)

瘦素是一种由脂肪细胞分泌的细胞因子，主要通过与下丘脑的瘦素长型受体结合，激活Jak蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase，Jak)/信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STATs)信号通路来调节摄食及能量代谢。我们在先前的研究中发现脂肪细胞也表达瘦素长型受体［1］，提示瘦素可能通过该受体对脂肪细胞产生直接作用。细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3)是瘦素信号转导的负反馈抑制因子，在中枢瘦素抵抗中起重要作用。关于脂肪细胞SOCS-3的研究报道却较少，因此，本研究拟通过体外实验，采用重组瘦素处理大鼠成熟脂肪细胞，探讨其对SOCS-3蛋白表达的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购于中国医科大学实验动物部。

1.2 试剂

大鼠重组瘦素(Sigma公司，美国)，Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，美国)，DMEM(Gibco公司，美国)，FBS(Clark公司，美国)，SOCS-3(H-103)抗体及 Protein A/G plus-Agrose(Santa Cruz公司，美国)，p-STAT1，p-STAT3抗体(Cell Signal公司，美国)。

1.3 大鼠成熟脂肪细胞的分离

无菌条件下获取大鼠双侧附睾脂肪组织，加Ⅱ型胶原酶于37℃水浴振荡孵育1 h，过250 μm筛网，DMEM洗细胞，50×g离心10 min，吸出下清液，上层白色物质即为成熟的脂肪细胞，加入10%FBS的DMEM混悬，接种细胞于6孔板，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育。

1.4 瘦素处理成熟脂肪细胞

依据文献［1］方法，采用 50 nmol·L－1的大鼠重组瘦素分别处理0.5、2、6 h，同时设置未处理组，收集细胞，迅速放入液氮中保存待测。每一浓度重复3次。

1.5 免疫共沉淀结合 Western blotting法检测SOCS-3、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达

全细胞裂解液裂解细胞，超声粉碎，4℃离心。蛋白定量，调整浓度，取200 μl细胞裂解液，按说明书加入SOCS-3抗体(H-103)(1∶100)4℃过夜，加入Protein A/G plus-Agrose 20 μl 4 ℃ 摇动 3 h，500 μl细胞裂解液洗细胞5次，离心，向沉淀中加入20 μl样品缓冲液，变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印，5%脱脂奶粉封闭1 h，再分别加入 SOCS-3抗体(H-103)(1∶1 000)、p-STAT1 抗体(1∶1 000)、p-STAT3 抗体(1∶1 000)4℃过夜，加入碱性磷酸酶标记的二抗室温2 h，碱磷酶显色液显色并拍照成像。Scion Image 4.03软件分析产物灰度值。

2 结 果

2.1 瘦素对脂肪细胞SOCS-3蛋白表达的影响

未经瘦素处理的脂肪细胞中有少量SOCS-3表达;当50 nmol·L－1瘦素处理0.5 h 和2 h 后 SOCS-3 蛋白表达略有增加，但差异无统计学意义(P＞0.05);在瘦素处理达6 h后，SOCS-3蛋白的表达量则显著增加(P＜0.01)。见图1。

图1 脂肪细胞SOCS-3蛋白在50 nmol·L－1瘦素处理前后表达变化Fig 1 The time-dependent expression of SOCS-3 protein in adipocytes with 50 nmol·L －1leptin treatment

2.2 瘦素处理前后脂肪细胞p-STAT1和p-STAT3蛋白表达变化

当瘦素处理2 h和6 h后，p-STAT1蛋白表达相比于未处理和处理0.5 h的显著增加(P＜0.01);但瘦素处理后2 h和6 h相比，p-STAT1蛋白表达无明显差异。见图2。

当瘦素处理6 h后，p-STAT3蛋白表达相比于未处理的显著增加(P＜0.01)，而瘦素处理0.5 h和2 h后的p-STAT3蛋白表达则无明显变化。见图3。

图2 脂肪细胞p-STAT1蛋白在50 nmol·L－1瘦素处理前后表达变化Fig 2 The time-dependent expression of p-STAT1 protein in adipocytes with 50 nmol·L － 1leptin treatment

图3 脂肪细胞p-STAT3蛋白在50 nmol·L－1瘦素处理前后表达变化Fig 3 The time-dependent expression of p-STAT3 protein in adipocytes with 50 nmol·L － 1leptin treatment

3 讨 论

瘦素抵抗是大多数肥胖者和啮齿类动物都存在的一种现象，其产生机制被认为与SOCS-3增多有关。许多研究表明，肥胖小鼠的下丘脑SOCS-3表达显著升高［2］，说明肥胖小鼠存在中枢瘦素抵抗。也有研究发现，肥胖大鼠脂肪组织SOCS-3水平也显著高于对照组，提示在脂肪组织中也可能存在瘦素抵抗现象［3］。

在中枢瘦素与OB-Rb结合，通过激活Jak/STAT途径诱导SOCS-3的产生，而产生的SOCS-3又可以抑制该途径的信号转导，使瘦素不能发挥减少体重的作用，产生瘦素抵抗。本研究发现，瘦素未处理的脂肪细胞中只有少量SOCS-3表达，而瘦素处理6 h后，SOCS-3蛋白的表达量显著增加，说明瘦素可以诱导脂肪细胞SOCS-3的产生，并具有时间依赖性。在Jak/STAT信号通路中，Jak是一种在细胞因子信号传递过程中起重要作用的蛋白酪氨酸激酶，它可在细胞因子与其受体结合后活化，并进而激活另一种信号蛋白分子STATs来诱导目的基因表达。STATs是一类脱氧核糖核酸结合蛋白，作为Jak-STAT途径中重要的Jak底物，STATs在细胞因子的信号转导中起着关键性的作用。哺乳动物细胞中发现的STAT家族成员主要包括STAT1 ～STAT6［4］，在中枢 SOCS-3 的产生主要是通过Jak2/STAT3途径。有研究报道，在3T3-L1脂肪细胞中，STAT1和STAT3信号转导通路可被白血病抑制因子、干扰素γ激活［5－6］。因此，本研究主要通过检测 p-STAT1和p-STAT3的表达来研究脂肪细胞中瘦素诱导SOCS-3产生的信号转导通路。

研究显示，当瘦素处理2 h和6 h后，p-STAT1蛋白表达相比于未处理和处理0.5 h的显著增加。当瘦素处理6 h后，p-STAT3蛋白表达相比于未处理的显著增加。提示在脂肪细胞中瘦素也是通过激活Jak-STAT信号通路，引起STAT1、STAT3的磷酸化，进而诱导SOCS-3的表达。由此可见，在肥胖状态下，肥大的脂肪细胞产生并分泌大量瘦素，而高浓度瘦素可以诱导产生更多的SOCS-3，过多的SOCS-3则可抑制瘦素信号转导通路，使瘦素不能发挥减少脂肪的效应，导致肥胖者脂肪细胞产生直接的瘦素抵抗。当然，在脂肪细胞中瘦素还将通过其他通路，如AMPK途径等发挥作用，所以，关于脂肪细胞瘦素抵抗的进一步机制还须深入探讨。

［1］刘莉，顾海伦，杨军，等.大鼠重组瘦素对成熟脂肪细胞细胞信号转导抑制因子3表达的影响［J］.卫生研究，2009，38(2):160-162.

［2］MUNZBERG H，FLIER J S，BJORBAEK C，et al.Regionspecific leptin resistance within the hypothalamus of diet-induced obese mice［J］.Endocrinology，2004，145(11):4880-4889.

［3］刘莉，顾海伦，赵越，等.瘦素抵抗肥胖大鼠脂肪组织SOCS-3、PPARγ 及 ACO mRNA 水平的探讨［J］.卫生研究，2008，37(1):40-42.

［4］HEINRICH P C，BEHRMANN I，MULLER-NEWE N，et al.Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway［J］.Biochem J，1998，334(Pt 2):297-314.

［5］JACQUELINE M，STEPHEN S，STEVEN J，et al.Activation of signal transducers and activators of transcription 1 and 3 by leukemia inhibitory factor，oncostatin-M，and interferon-γ in adipocytes［J］.J Biol Chem，1998，273(47):31408-31416.

［6］WADA T，HOSHINO M，KIMURA Y，et al.Both typeⅠandⅡIFN induces insulin resistance by inducing different isoform of SOCS expression in 3T3-L1 adipocytes［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，300(6):E1112-E1123.