预处理星形胶质细胞GDNF神经元保护机制研究

李昕华

(胥桂华长春市中心医院神经内科 长春 130000)

研究发现星形胶质细胞可通过上调其培养基(Astrocyte medium,AM)中的营养因子发挥脑保护作用,从而减轻缺血、缺氧对神经元造成的损害[1]。AM经离心、过滤后可制成条件培养基(Astrocyte conditioned medium,ACM),用于细胞培养,以判断营养因子的作用。本实验给予星形胶质细胞不同处理后制备ACM,通过不同ACM对缺氧神经元凋亡的影响,探讨预处理星形胶质细胞GDNF脑保护作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

出生12hWistar大鼠:皮层神经元原代培养;出生1～2d Wistar大鼠:星形胶质细胞原代培养。

1.2 实验方法

1.2.1 神经元和星形胶质细胞原代培养 采用酶消化法结合机械分离法。

1.2.2 制备缺氧预处理细胞模型 将培养第6天的神经元和第9天的星形胶质细胞放入厌氧培养箱孵育,取孵育30、90min作为预处理及缺氧时间,给予神经元不同处理后分成3组:对照组

(control)、预处理+缺氧组(IPC+HY)、缺氧组(HY)。

1.2.3 制备ACM ACM1为正常AM,ACM2为预处理及再缺氧后GDNF高表达的AM,ACM2加入GDNF抗体中和后即为ACM3。

1.2.4 检测神经元凋亡 分别用3种ACM孵育3组神经元,培养24h后,采用AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术(FCM)检测神经元凋亡。

表1 流式细胞术检测神经元凋亡率[n=36,%,(±s)]

表1 流式细胞术检测神经元凋亡率[n=36,%,(±s)]

注:*P<0.05 compared with control group,#P<0.05 compared with HY group, △P<0.05 compared with ACM1 and ACM3 group

ACM1 ACM2 ACM3 control 4.28±0.27 5.31±0.58 5.63±0.49 IPC+HY (40.38±0.74)*# (26.34±0.52)*#△ (46.15±1.09)*#HY (52.13±0.64)* (41.62±0.67)* (55.34±1.11)*

1.3 统计学分析

2 结果

不同ACM对正常对照组神经元凋亡率无影响(P>0.05)。正常对照组早期神经元凋亡率明显低于另外2组(P<0.05),预处理+缺血组神经元用ACM2孵育后凋亡率低于ACM1及ACM3组(P<0.05),结果见表1。

3 讨论

在脑组织缺血过程中星形胶质细胞发挥重要作用,通过分泌营养因子和摄取离子等方式发挥脑保护机制[2],在缺血时如何减轻神经元凋亡是脑保护的难题[3],本实验用厌氧培养箱孵育神经元和星形胶质细胞,模拟中枢神经系统缺血预处理及再缺血过程,用不同ACM培养受损神经元,建立体外星形胶质细胞/神经元相互作用体系,用AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测神经元凋亡,说明缺氧预处理诱导星形胶质细胞GDNF表达增加,阻止神经元早期凋亡的发生。

[1]Dienel GA, Hertz L. Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia[J].Glia.2005,50:362～388.

[2]Lee SH, Kim M, Yoon BW,et al.Targeted hsp70 disruption increases infarction volume after focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke,2001,32(12):2905～1912.

[3]Le DA,Wu Y,Huang Z,et al.Caspase activation and neuroprotection in caspase-3 deficient mice after in vivo cerebral ischemia anti in vitro oxygen glucose deprivation[J].Proc Nail Acad Sci USA,2002,99:15188～15193.