BDNF基因修饰真皮多能干细胞移植对脊髓损伤的修复作用*

宗兆文,张连阳,沈 岳,郭庆山,任永川,冉新泽,史春梦,程天民

(1.第三军医大学大坪医院/野战外科研究所全军战创伤中心创伤科,重庆400042;2.第三军医大学全军复合伤研究所国家创伤、烧伤与复合伤重点实验室复合伤分室,重庆400038)

脊髓损伤(spinal cord injury)后的功能恢复是医学研究的难点之一,其修复的主要策略包括减少脊髓损伤后的继发性损伤,采用组织或细胞移植促进中枢神经系统的可塑性变化以及应用刺激神经生长的因子和(或)阻断抑制轴突生长的物质以促进受损轴突的再生等[1-2]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是研究最为广泛的神经营养素之一,在神经系统中的作用广泛而强大。大量的实验证实,BDNF可以保护脊髓运动神经元,并可促进红核脊髓束和皮质脊髓束轴突再生或出芽[3-4]。而干细胞移植被认为是修复脊髓功能损伤最有前景的方法之一,本课题前期实验发现真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cell,dMSCs)可在体外被诱导为神经元和胶质细胞[5-7],其他学者也证实dMSCs移植后可促进脊髓损伤后的功能恢复[8]。为了同时发挥dMSCs和BDNF的修复效果,本研究观察了BDNF腺病毒表达载体(adenovirus vector of BDNF,Adv-BDNF)感染的dMSCs移植后对脊髓损伤的修复效果,报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物和主要试剂 Wistar大鼠购自第三军医大学大坪医院动物所。Adv-BDNF由本实验室张正丰博士构建并馈赠。兔抗鼠BDNF多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)结合的第二抗体购自Sigma-Aldrich公司。免疫组化试剂盒购自Boster公司。细胞培养用培养瓶、培养基及血清等购自Hyclone公司。

1.2 dMSCs的分离培养与转染 参照本研究所建立的早期贴壁法进行dMSCs的分离培养和鉴定[9]。方法简述如下:新生1 d Wistar大鼠,引颈处死,乙醇消毒,剪取皮肤置于0.25%胰酶消化过夜;次日,用磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)清洗,去除表皮和皮下组织,将真皮组织剪成细胞碎片并吹打成细胞悬液,过滤并接种于培养瓶中;6 h后,弃培养液和悬浮细胞,继续培养早期贴壁细胞;反复传代至有集落样细胞群体产生,按常规方法接种和选取细胞克隆,传代备用;dMSCs移植前4 h向其培养基中加入0.2 mL第3代Adv-BDNF病毒原液(病毒滴度约为1.5×1010PFU/mL,PFU为plaque-forming unit,即空斑形成单位);继续培养4 h后收集dMSCs,制成浓度为 1×107/mL的细胞悬液,备用。

1.3 建模、细胞移植与分组 成年Wistar大鼠72只采用改良Allen重物打击法制作脊髓损伤模型[10],方法简述如下:将麻醉后的大鼠俯卧位固定,显露T10节段脊髓,用质量20 g、打击头直径2.5 mm的打击器自2.5 cm高处自由落下,造成T10节段脊髓打击伤。受伤大鼠随机分为 A、B、C、D四组:A组接受Adv-BDNF感染的dMSCs移植(n=18),将 100 μ L感染Adv-BDNF的dM SCs悬液缓慢用微量注射器注入损伤脊髓处,注射完毕留针5 min以防细胞渗漏。B组接受未感染Adv-BDNF的 dMSCs移植(n=18)。C组接受单纯 Adv-BDNF注射(n=18)。D组为单纯脊髓损伤(n=18)。其中,B、C组的注射方式、部位、细胞密度及液体用量与A组相同。为防止膀胱感染,术后人工挤压膀胱排尿,2次/天。

1.4 免疫荧光组织化学检测 细胞移植后3 d和7 d,每组取6只大鼠引颈处死后取材,95%乙醇固定,常规制备5 μ m厚的脊髓石蜡切片,PBS漂洗3次,血清封闭后加兔抗鼠BDNF多克隆抗体,4℃孵育过夜。PBS漂洗3次后加荧光第二抗体,室温孵育1 h。荧光显微镜观察。

1.5 损伤脊髓局部凋亡细胞检测 取伤后3 d大鼠脊髓,每组6只,常规消化、离心,冷PBS洗细胞 2次,加入预冷70%乙醇,4℃固定过夜。离心收集细胞,以1 mL的PBS洗涤细胞1次,加入 500 μ L 含 50 μ g/mL 溴 化乙锭 、100 μ g/mL RNA 酶A、0.2%Triton X-100的PBS,采用流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。

1.6 行为学检测 伤后7 d采用BBB(Basso,Beattie and Bresnahan locomotor rating scale)神经行为学评分法评定大鼠的功能恢复情况[11-12],功能评价完毕,取材进行上述1.4步骤的免疫组织化学检测。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析,计量资料用±s表示,t检验进行组间分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脊髓损伤后大鼠脊髓中BDNF的表达 BDNF阳性细胞呈绿色荧光。A组大鼠损伤的脊髓中有大量较强的绿色荧光,为BDNF阳性细胞,大部分呈长梭状,少数为神经元样细胞(封2图1 A),提示大部分BDNF阳性细胞为dMSCs,其余可能为少数dM SCs坏死崩解后释放病毒感染脊髓损伤局部的神经元或脊髓损伤引起局部反应而出现神经元BDNF的阳性表达。C组大鼠局部可见大量BDNF阳性细胞,多为神经元形状(封2图1 C),提示Adv-BDNF局部注射可有效地感染脊髓损伤局部的神经细胞。B组和D组脊髓损伤局部BDNF阳性细胞数量明显稀少(封2图1 B、D)。伤后 7 d,A组和C组大鼠脊髓损伤局部BDNF阳性细胞数量无明显减少,B组和D组阳性细胞数量也无明显变化。

图2 脊髓损伤7 d大鼠的BBB神经行为学评分

2.2 脊髓损伤后大鼠脊髓中细胞的凋亡 脊髓损伤急性期(1～3 d)为局部细胞凋亡的高峰期,因此,本研究观察脊髓损伤3 d时细胞的凋亡情况。结果显示A组大鼠脊髓损伤局部细胞的凋亡率为(4.7±0.4)%,略低于C组(4.9±0.3)%,差异无统计学意义(P＞0.05),但其明显低于 B组[(6.2±0.4)%](P＜0.05)和D组[(6.7±0.5)%](P＜0.05)。

2.3 BBB神经行为学评分法对大鼠神经功能的评价 伤后7 d A组大鼠神经功能恢复最好,明显优于其他各组(P＜0.05);B组和C组大鼠功能恢复相当,差异无统计学意义(P＞0.05),但二者均高于 D组(P＜0.05)。见图2。

3 讨 论

干细胞移植被认为是修复脊髓损伤最有前景的方法之一。相对于神经干细胞和胚胎干细胞,皮肤来源的干细胞移植具有取材方便、来源丰富、可进行自体移植等诸多优点。目前,已经从真皮中分离到包括dMSCs、皮肤源性前体细胞等多种干细胞,均可在适当的条件下被诱导为神经元或胶质细胞,移植后可促进损伤的脊髓神经功能恢复[8,13-14]。本研究的前期实验显示,dMSCs在体外可被诱导为神经元和胶质细胞,提示dMSCs可作为修复脊髓损伤的合适选择。

使用神经营养素是修复脊髓损伤的另一策略。BDNF是目前被证实的作用最强的神经营养因子,可促进神经元的存活以及受损红核脊髓束和皮质脊髓束轴突的再生或出芽[3-4],在脊髓损伤的修复中具有重要作用。为了同时发挥BDNF和dMSCs的作用,本研究采用腺病毒感染的方法用BDNF基因修饰dMSCs,然后将其移植到脊髓损伤局部,结果表明较单纯dMSCs移植和单纯BDNF基因修饰,接受Adv-BDNF感染的dMSCs移植能更好地促进神经功能的恢复。

本研究初步探讨了BDNF基因修饰dMSCs的移植对脊髓损伤的修复作用。结果表明BDNF基因修饰可减少脊髓损伤局部细胞的凋亡,对脊髓损伤后的二次损伤具有一定的预防作用。而dMSCs的作用可能不是通过减少局部细胞的凋亡来实现,因为单纯dMSCs移植组脊髓损伤局部细胞的凋亡率高于单纯BDNF修饰组,但两组大鼠的神经功能恢复并无显著差异,提示dMSCs对损伤脊髓功能恢复的促进还可能存在其他机制,如dMSCs在脊髓损伤局部分化为神经元和胶质细胞而参与损伤修复。BDNF基因修饰dMSCs移植还可能通过保护大脑皮层的投射神经元(如皮质脊髓束),使其免于细胞凋亡以及促进损伤轴突的再生[15],从而达到修复损伤的目的。这些可能机制还需进一步深入探讨。

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