菊藻丸含药血清对人激素非依赖性前列腺癌细胞增殖和周期的影响*

杨卲波 刘海涛 董树猛 贾贤军 刘 平

湖南中医药大学第二附属医院（湖南长沙410005）

内分泌治疗是目前晚期前列腺癌的首选治疗方法，但几乎所有患者最终都将转化为激素非依赖。以多西他赛为基础的化疗可延长激素非依赖性前列腺癌患者的生存时间，但总体生存时间仍然较短，且副作用大。中医药治疗是最常用的替代疗法之一。本实验以本院自制的抗肿瘤中药菊藻丸，用血清药理学方法检测含药血清对人激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3增殖、细胞周期分布的影响，为下一步的动物荷瘤实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠16只，体质量209～285g，购于中南大学实验动物中心。菊藻丸（购于我院制剂室，主要药物为野菊花、海藻、马钱子、山豆根、黄柏、黄连、莪术等）10g加三蒸水70mL浸泡24h，过滤，离心取上清液，原药物质量浓度为285.7ng/mL，设 3 个剂量组，即 28.6、2.86、0.286ng/mL。 新生牛血清为杭州四季青公司产品。HAMF-12培养液（含体积分数10%新生牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL）、四甲基偶氮唑盐（MTT）为美国Sigma公司产品。酶联免疫检测仪为Bio-Rad公司产品。人激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3购于上海信然生物技术有限公司。

1.2 模型制备根据文献［1］报道的手术方法建立去势模型。用10%水合氯醛注射液按3.5mL／kg剂量作腹腔注射麻醉。碘伏原液消毒、铺巾。取阴囊部横切口，依次切开皮肤、肉膜、睾丸壁层鞘膜。将睾丸拉出切口，游离精索，结扎后切断，移除标本。先行一侧手术，然后行对侧手术，两侧手术方法相同。创面止血，缝合切口。手术当天肌注青霉素100万U／（kg·d），分3次注射，每8小时1次，第1次于手术前2h应用。

1.3 含中药血清的制备将去势大鼠随机分为菊藻丸高、中、低剂量组和空白对照组，每组4只。去势手术后1周，菊藻丸高、中、低剂量组分别予28.6、2.86、0.286ng／mL菊藻丸水剂灌胃（人-大鼠体表面积等效剂量比率为1∶0.018）；对照组动物以生理盐水灌胃，均每次4mL，每日2次，共3d。于末次给药后60～90min，用10%水合氯醛注射液按3.5mL／kg剂量腹腔注射麻醉动物后，均于下腔静脉取血，置于无抗凝管内。室温下静置30min，待凝血坚固，血清析出。按1200g离心15min后，吸出上清即为含药血清或空白血清。同组血清混合，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置于-20℃保存备用。

1.4 细胞培养按常规方法复苏PC-3细胞系，接种于HamF-12培养液的75cm2培养瓶中，于37℃、体积分数5%及饱和湿度恒温培养箱中培养，每2～3日更换培养液1次，70%～80%满时传代，传代时用 2.5g／L 胰蛋白酶。

1.5 MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞，用HamF-12培养液稀释成2.5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL，培养24h，待细胞贴壁。弃去培养液，分别加入含药血清或空白血清的 Ham F-12培养液 180μL， 分别培养 0、20、44、68h。每孔加入 20μL MTT（5mg/mL），再培养 4 h。弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，待甲臜完全溶解后，用酶联免疫检测仪在波长570nm处调零后读取光密度（D值）。每组每时段均设10个重复孔，细胞存活率=（含药血清孔D值／空白血清孔D值）×100%。

1.6 细胞周期的检测取对数生长期细胞，用HamF-12培养液稀释成5.0×104/mL的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔3.0mL，培养24h，待细胞贴壁。弃去培养液，分别加入含药血清或空白血清的HamF-12培养液3mL。培养48h后，经消化、离心收集细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定过夜。上机前细胞经PBS洗涤 2次后加入 RNaseA （0.1mg/mL）， 放置 37℃孵育30min，碘化丙碇染色，用流式细胞仪测定细胞周期。采用CellQuest软件分析周期的百分数，重复5次。

1.7 统计学处理应用 SPSS 13.0统计软件。 结果以（±s）表示，采用方差分析比较组间差异，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各时段各组细胞的光密度各组细胞的光密度随培养时间延长均呈增加趋势 （见图1）。

图1 各组细胞光密度曲线图

2.2 各组含药血清对PC-3存活率的作用见表1。3组含药血清处理PC-3细胞4h，细胞存活率均升高，各组间比较差异无统计学意义。处理24h，含药血清中、低剂量组存活率升高，高剂量组存活率降低，与中、低剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。处理48h，含药血清低剂量组存活率升高，高、中剂量组存活率降低，高剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05），处理72h低剂量组存活率升高，高剂量组和中剂量组细胞存活率降低，各组间比较差异有统计学意义（P均<0.05）。低剂量组处理4、24、48、72h，细胞存活率均升高，各时间段间差异无统计学意义。中剂量组处理4、24h，细胞存活率升高；处理48、72h，细胞存活率降低，二者相比差异无统计学意义；处理72h与4、24h 比较差异有统计学意义（P<0.05）。 高剂量组处理 4h，细胞存活率升高，处理24、48、72h，细胞存活率降低，与处理4h相比差异有统计学意义（P<0.05），且处理72h与处理24h相比差异有统计学意义（P<0.05），前者细胞存活率降低更明显。

表1 各组含药血清对PC-3存活率的影响 （%，±s）

表1 各组含药血清对PC-3存活率的影响 （%，±s）

与含药血清高剂量组同时期比较，*P＜0.05；与本组72h时比较，△P＜0.05。

组 别 n 4h 24h含药血清高剂量组 10 110.40±13.80△ 87.40±7.50△48h 81.50±6.20含药血清中剂量组 10 101.60±12.70△ 108.50±21.60*△97.20±14.80含药血清低剂量组 10 103.20±12.40 106.40±20.30*72h 77.30±9.50 82.40±10.90*110.30±16.80*115.40±13.50*

2.3 各组含药血清对PC-3细胞周期的作用见表2。含药血清各组的细胞周期分布与空白血清组相比差异均无统计学意义。含药血清中、低剂量组G1-G0期细胞比例增多，与高剂量组相比差异有统计学意义（P<0.05）。高剂量组G2／M期细胞比例比中剂量组高，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 各组含药血清对PC-3细胞周期的作用 （±s）

表2 各组含药血清对PC-3细胞周期的作用 （±s）

与含药血清高剂量组同细胞周期比较，*P＜0.05。

组 别 n G1-G0（%） S（%）空白血清组 5 61.30±1.80 23.30±0.50含药血清高剂量组 5 59.10±5.60 22.30±3.10 G2/M 15.50±2.50 18.60±4.30含药血清中剂量组 5 66.40±1.70* 20.40±4.20 13.40±3.60*含药血清低剂量组 5 65.20±1.60* 18.50±2.80 15.60±2.70

3 讨 论

现有文献报道的关于中药体外实验的研究大多数是利用中药复方或单味中药的提取物直接加入体外培养体系。这不仅与临床应用中药复方水煎剂治疗有差异，而且不能反映药物经机体代谢后活性成分改变，及药物作用后机体免疫力的改变。日本学者Iwama等［2］率先提出“血清药理学方法”。 此法是将中药给动物灌胃一定时间后，采集动物血液分离血清，用含药血清进行体外实验。这种方法不仅防止了中药本身理化性质（pH、渗透压、无机盐离子、鞣质等）对体外实验的干扰，又模拟了药物在体内对细胞生物特性的影响；不仅反映了药物可吸收部分的直接作用，而且能反映药物在机体作用下所产生的代谢物质和药物所诱生的机体内源性物质的间接效应，实现了体外与体内实验的完美结合。

前列腺癌的中医辨证论治可分为湿热蕴结证、瘀血内阻证、阴虚内热证、肾气亏虚证。前列腺癌治疗主要采用活血化瘀、清热利湿、软坚散结和补肾利尿等方剂。菊藻丸本着“坚者削之、客者除之，结者散之，留者攻之”之理，选用野菊花、黄连、黄柏、山豆根等清热燥湿、解毒消肿，臣以莪术、马钱子破血行瘀，通络消积止痛 ，佐以海藻软坚散结。实验提示其可能是通过提高或保护自然杀伤细胞的活性而发挥抗肿瘤作用［3］。有关药理研究表明［4-5］，野菊花、黄连、山豆根、莪术、马钱子、海藻等均具有抗肿瘤细胞作用，可抑制癌细胞嘌呤及核酸的合成，对肿瘤细胞有直接杀伤作用。

本实验中高、中剂量的含药血清可抑制PC-3细胞的生长，且随作用时间的延长其抑制作用也随之增强，而低剂量组含药血清无明显抑制作用 ，考虑为药物质量浓度过低所致。以上结果表明菊藻丸对PC-3细胞有一定的抑制作用，且存在一定的量效、时效关系，由此表明菊藻丸有明显的细胞毒作用，可直接抑制癌细胞的生长。

本次实验的细胞周期分析表明，各处理组PC-3细胞的各期细胞比例与空白血清组相比差异无统计学意义。但中、低剂量组和G1期细胞比例比高剂量组高，差异有统计学意义。高剂量组G2期细胞比例比中剂量组高，差异有统计学意义；细胞G1期比例高可能是（1）细胞周期阻滞的结果，（2）其他时相（S期和G2／M 期）细胞的优先持续死亡，（3）二者同时起作用的结果［6］。G2期细胞比例增加，与细胞停滞于G2/M期细胞检查点有关。各含药血清组与空白血清组相比对PC-3细胞周期影响不明显，但三者之间却表现差异。提示各含药血清组与空白血清组对PC-3细胞周期作用机制可能不同，具体机制有待进一步阐明。

菊藻丸是我院已故外科教授肖梓荣行医60余年治疗恶性肿瘤的经验方，临床应用于多种恶性肿瘤的治疗，疗效确切。本研究结果表明菊藻丸可抑制PC-3细胞的生长，为应用菊藻丸治疗雄激素非依赖性前列腺癌的进一步研究提供了依据。

［1］Hinman F.Hinman’s Atlas of urologic surgery［M］.Philadelphia：w.B.Saunders Company，2002：1016-1026.

［2］Iwama H.Effect of Shosaikoto，a Japanese and Chinese traditional herbal medical mixture on the mitogenic activity of 1.popolysaccharide：Anewpharmacologytestingmethod［J］.JEthnopharmacal，1987，21（1）：45-53.

［3］杨志波，欧阳恒，罗文辉，等.菊藻丸对免疫抑制小鼠天然杀伤细胞的影响［J］.湖南中医学院学报，1999，19（3）：1.

［4］郑虎占，董泽宏，余靖.中药现代研究与应用［M］.北京：学苑出版社，1997：551，783，4014，4055.

［5］张瑾峰，王酷，刘欣，等.莪术、三棱和白介素-6对人乳腺癌细胞凋亡的诱导［J］.首都医科大学学报，2006，27（4）：492-493.

［6］Chen S，Ruan Q，Bedner E，et al.Effects of the flavonoid baicalin and its metabolite baicalein on androgen receptor expression，cell cycle progression and apoptosis of prostate cancer cell lines［J］.Cell Prolif，2001，34（5）：293-304.