OPN在喉癌组织中的表达变化及LV-shOPN对喉癌Hep-2细胞侵袭转移的影响

陈剑秋 ，朱敏辉，邱晓霞，夏思文，刘 达，陈世彩，郑宏良

(1济南军区总医院，济南250031;2第二军医大学附属长海医院)

95%的喉癌为鳞状细胞癌。复发和侵袭转移是喉癌患者死亡的主要原因。肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的复杂过程。基因改变贯穿了肿瘤病变的全过程。因而，从基因水平控制喉癌的侵袭和转移，是提高疗效的关键。骨桥蛋白(OPN)是首先在骨基质中发现的一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，其中含有特异的与细胞黏附有关的RGD序列，通过其受体整合素、CD44等来促进细胞的趋化、黏附、迁移和增殖，从而介导肿瘤细胞的侵袭转移［1］。RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA诱发的在mRNA水平上的基因沉默机制，可以有效并特异地抑制靶基因的表达［2］。本研究首先观察了喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中OPN的表达变化;然后通过RNAi技术下调喉癌Hep-2细胞中OPN的表达，观察该细胞增殖和侵袭能力的变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1．1 临床资料 2003年1月～2005年12月经病理检查确诊的LSCC患者44例，男40例，女4例;年龄38～76岁。临床分期(2002年，UICC):Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。肿瘤分化程度:高分化20例，中分化16例，低分化8例。肿瘤类型:声门上型14例，声门型25例，声门下型5例。所有患者术前未实施放疗和化疗。术中留取癌组织及癌旁正常组织(取自距癌1 cm处的喉组织，病理检查未见癌细胞浸润)。上述标本常规制作石蜡包埋切片，厚4 μm。

1．2 主要试剂及细胞株 即用型鼠抗人OPN单克隆抗体，DAB显色试剂盒，免疫组化SP染色试剂盒，GAPDH抗体，MTT试剂盒，细胞侵袭检测试剂盒。Hep-2喉癌细胞株，干扰OPN慢病毒载体(LV-shOPN)。

1．3 癌及癌旁正常组织中OPN的检测 标本切片采用免疫组化SP法染色，DAB显色，苏木素复染、脱水，树脂封固，镜下观察。细胞质中出现棕黄色颗粒者为OPN阳性细胞。细胞未染色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞百分比＜5% 为0分、5% ～25%为1分、26% ～50%为2分、＞50%为3分。上述2种分值的乘积≤3定为阴性、＞3定为阳性。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1．4 Hep-2细胞培养及LV-shOPN转染 Hep-2细胞加入含10%胎牛血清的 DMEM，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。取适量细胞接种在6孔板中至60% ～70%融合后转染LV-shOPN，培养24 h后更换新鲜培养基继续培养。LV-shOPN转染后细胞命名为Hep-2-LV-shOPN，转染空载体的细胞命名为Hep-2-LV-shNone。

1．5 细胞OPN检测 采用Western blot法。收集Hep-2细胞及转染72 h后的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone，PBS洗涤2次，离心弃上清，每孔加入0．2 ml细胞裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 g离心20 min，收集上清。取50 μg蛋白质加入2×上样缓冲液，经100℃、5 min变性后用10%的SDS-PAGE分离。蛋白质转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。分别加入 OPN及GAPDH一抗，4℃过夜，TBST洗涤3次，加入二抗(Santa cruz)，室温孵育1 h，TBST洗涤4次。加显色剂1 min，X线胶片曝光成像。图像用Quantity one 4．4软件进行定量分析。

1．6 细胞增殖活性检测 采用MTT法。收集培养1、2、3、4、5 d 的 Hep-2 细胞及转染 1、2、3、4、5 d 的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone，分别制成单细胞悬液，按5×103/孔接种于96孔板，每天各取3个复孔的细胞，用MTT法检测细胞增殖活性(用OD值表示)。

1．7 细胞侵袭力检测 采用Transwell小室实验。取Hep-2细胞及转染72 h后的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone。按照侵袭实验试剂盒说明，各设3个复孔。于Transwell小室的上室加入细胞1×106/孔(无血清培养基的单细胞悬液)，下室加入完全培养基，培养24 h。培养结束后用棉拭子将Transwell上室细胞擦去，穿过聚碳酸酯膜的细胞用结晶紫染色，清水冲洗数次，空气干燥后显微镜下观察照相，10×20视野下随机选取5个视野计数细胞(代表细胞侵袭力)，取均值。

1．8 统计学方法 采用SPSS15．0统计软件。数据比较用t检验、χ2检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 OPN蛋白表达及其与LSCC临床病理参数的关系 LSCC组织和癌旁正常组织中OPN阳性表达率分别为 75．0%(33/44)、13．6%(6/44)，两者相比，P＜0．01。OPN的表达与LSCC临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(P均＜0．05)，与患者年龄、性别、LSCC临床类型无关(P均＞0．05)，详见表1。

表1 OPN表达与LSCC临床病理参数的关系

2．2 Hep-2细胞及转染细胞 OPN表达比较Hep-2、Hep-2-LV-shOPN和 Hep-2-LV-shNone细胞OPN 的相对表达量分别为0．60 ±0．01、0．15 ±0．02和0．54 ±0．02，Hep-2-LV-shOPN 细胞 OPN 的表达量较其他两种细胞明显下调(P均＜0．01)。

2．3 Hep-2细胞及转染细胞的增殖活性 不同时间点 Hep-2、Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone细胞的OD值比较见表2。

2．4 Hep-2细胞及转染细胞侵袭力比较 穿过聚碳酸酯膜的 Hep-2、Hep-2-LV-shOPN和 Hep-2-LV-shNone的细胞数分别为(60．66 ±0．88)、(25．33 ±0．88)和(58．33 ±0．79)个，穿过聚碳酸酯膜的 Hep-2-LV-shOPN细胞数较其他两种细胞明显减少(P均＜0．01)。

表2 不同时间点三种细胞的OD值比较(±s)

表2 不同时间点三种细胞的OD值比较(±s)

注:与 Hep-2、Hep-2-LV-shNone细胞相比，*P ＜0．05

细胞OD值1 d 2 d 3 d 4 d 5 d Hep-2 0．411 ±0．001 0．833 ±0．002 1．123 ±0．001 1．297 ±0．003 1．347 ±0．002 Hep-2-LV-shOPN 0．404 ±0．001* 0．460 ±0．001* 0．605 ±0．003* 0．740 ±0．002* 0．744 ±0．004*Hep-2-LV-shNone 0．365 ±0．003 0．542 ±0．001 0．955 ±0．003 1．075 ±0．004 1．211 ±0．001

3 讨论

OPN在多种肿瘤患者的血浆中高表达［3］，因此被认为是肿瘤转移相关基因蛋白。OPN在肿瘤中高表达与乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌、直肠癌的发生发展和侵袭转移密切相关［4～7］，它能够反映肿瘤恶性程度及转移侵袭能力。

Celetti等［8］研究发现，LSCC 患者血清中 OPN过度表达。本研究发现，LSCC组织中OPN的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，OPN的表达与LSCC临床分期、分化程度、淋巴结转移有关，OPN阳性表达者恶性程度高、侵袭力强、易发生转移。提示OPN可作为LSCC的标志物及侵袭转移能力的判断指标之一。

RNAi是转录后水平的基因沉默技术，可特异地下调靶基因的表达。该技术能快速、高效地阻滞肿瘤细胞或组织中异常、突变蛋白的表达。相对于基因敲除、反义寡核苷酸干扰等技术，RNAi技术具有操作更简单、抑制作用更完全、特异性更高等特点。本研究在体外将OPN基因的RNAi慢病毒载体转染喉癌Hep-2细胞，该细胞中OPN的表达下调，其增殖活性及侵袭力被抑制。这一结果为以OPN为靶点的喉癌基因治疗提供了理论依据。

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