温和灸对自然衰老模型大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC表达的影响

谭琳蓥 赵天平 国兰琴 赵琛 刘慧荣 朱慧华 崔云华

衰老是生物体各种功能普遍衰弱，以及抵抗环境伤害和恢复体内平衡能力降低的过程[1]。近年来，全球老年人口比重迅速上升[2]，探索衰老机理，延缓衰老、防治与衰老相关的疾病、提高老年人的生活质量，对全球的经济发展和卫生事业将带来重大的影响。本研究采用自然衰老大鼠模型，观察温和灸“肾俞”穴对自然衰老大鼠肝组织原癌基因Rb(Rb)、原癌基因P53(P53)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、蛋白激酶C(PKC)表达的影响，以期进一步探讨艾灸延缓衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由上海中医药大学实验动物中心提供的2月龄雄性清洁级SD (Sprauge-Dawley)大鼠共24只，SPF级，体重(160±20)g，适应性饲养1周后，随机分为正常组8只、自然衰老组8只、艾灸组8只。

1.2 主要试剂与仪器

Rb原位杂交试剂盒、P53原位杂交试剂盒、Bcl-2原位杂交试剂盒、PKC原位杂交试剂盒、羊抗兔SABC试剂盒、羊抗小鼠SABC试剂盒、兔抗大鼠Rb多克隆抗体、小鼠抗大鼠P53单克隆抗体、小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗大鼠蛋白酶C单克隆抗体、DAB显色试剂盒等选用武汉博士德生物工程有限公司产品；仪器包括恒温杂交炉(OLS 200)、显微镜(OLYMPUS BH2)、Motic图像分析系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.3 造模方法

SD大鼠适应性饲养1周后，在SPF级环境设施中正常饲养20个月，待其自然进入衰老期[4]。

1.4 分组与处理

正常组：正常情况下饲养9周。

自然衰老组：正常情况下饲养20个月。

艾灸组：温和灸肾俞穴[3]，每日1次，每次5分钟，5次为一疗程，每疗程结束后休息2天，再进行下一疗程，共治疗20个月。

1.5 标本采集

实验结束后处死各组大鼠，摘取肝脏，分别置于液氮或10%中性甲醛固定液中保存备用。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 原位杂交方法检测大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA的表达

原位杂交探针由复旦科技有限公司合成。引物序列、探针长度见表1。Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA原位杂交检测按试剂盒说明书进行。

阴性对照：以预杂交液代替杂交液，并完成整个过程。

棕黄色为阳性信号，阴性对照无阳性着色。每张片子随机采集3个视野，运用MOTIC图象分析系统对阳性表达面积和阳性表达光密度进行分析。

表1 Rb、P53、Bcl-2、PKC引物序列与探针长度

1.6.2 免疫组化方法检测大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC的蛋白表达

Rb、P53、Bcl-2、PKC蛋白免疫组化检测按试剂盒说明书进行。

阴性对照：以抗体稀释液代替第一抗体孵育，并完成整个操作。

棕黄色为阳性信号，阴性对照无阳性着色。每张片子随机采集3个视野，运用MOTIC图象分析系统对阳性表达面积和阳性表达光密度进行分析。

1.7 统计学处理

各组均值以表示，应用SPSS 11.0统计软件，进行单因素方差分析，不符合方差分析条件的，采用秩和检验。

2 结果

2.1 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb mRNA表达的影响

表2、图1显示，自然衰老组大鼠肝组织Rb mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01)，艾灸组肝组织Rb mRNA阳性表达面积显著低于自然衰老组(P<0.01)，但未达到正常水平(与正常组比较P<0.05)。艾灸组肝组织Rb mRNA阳性表达光密度也显著降低(P<0.01)，且与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。

2.2 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53 mRNA表达的影响

表3、图2显示，自然衰老组大鼠肝组织P53 mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.05，P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织P53 mRNA阳性表达面积与阳性表达光密度均显著低于自然衰老组 (P<0.05，P<0.01)，但均未达到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表2 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb mRNA表达的影响

表3 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53 mRNA表达的影响

2.3 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2 mRNA表达的影响

表4、图3显示，自然衰老组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达面积显著高于自然衰老组(P<0.01)，但未达到正常水平(与正常组比较P<0.05)。艾灸组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达光密度也显著增强(P<0.01)，且与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。

表4 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2 mRNA表达的影响

2.4 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC mRNA表达的影响

表5、图4显示，自然衰老组大鼠肝组织PKC mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织PKC mRNA阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01)，但均未达到正常水平(P<0.01，P<0.05)。

表5 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC mRNA表达的影响

2.5 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb蛋白表达的影响

表6、图5显示，自然衰老组大鼠肝组织Rb蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织Rb蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于自然衰老组(P<0.01)，但与正常组比较仍有显著性差异(P<0.01)。

表6 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb蛋白表达的影响

2.6 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53蛋白表达的影响

表7、图6显示，自然衰老组大鼠肝组织P53蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织P53蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著低于自然衰老组(P<0.01)，但与正常组比较仍有显著性差异(P<0.01)。

表7 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53蛋白表达的影响

注： 与正常组比较：aP<0.01，与自然衰老组比较：bP<0.01

2.7 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2蛋白表达的影响

表8、图7显示，自然衰老组大鼠肝组织Bcl-2蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织Bcl-2蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01)，但均未达到正常水平(P<0.01)。

表8 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2

2.8 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC蛋白表达的影响

表9、图8显示，自然衰老组大鼠肝组织PKC蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01)，艾灸组大鼠肝组织PKC蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01，P<0.05)，但均未达到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表9 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC

图1 各组大鼠肝组织Rb mRNA的表达

图2 各组大鼠肝组织P53 mRNA的表达

图3 各组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA的表达

图4 各组大鼠肝组织PKC mRNA的表达

图5 各组大鼠肝组织Rb蛋白的表达

图6 各组大鼠肝组织P53蛋白的表达

图7 各组大鼠肝组织Bcl-2蛋白的表达

图8 各组大鼠肝组织PKC蛋白的表达

3 讨论

衰老的发生由多种信号触发所致，肿瘤抑制基因是其中之一[4-7]。研究显示：Rb、P53、Bcl-2、PKC与衰老关系密切。Rb、P53是一类负性细胞周期的调控蛋白，为延缓衰老的负相调控因子，抑制细胞增殖，使细胞停滞于G1期，参与细胞周期分裂、衰老与凋亡。在衰老的细胞中，Rb仅以其活性的低磷酸化的生长抑制形式存在[8]。P53是序列特异性转录调控因子，通过直接或间接的方式活化或抑制其靶基因，介导细胞的生长停滞或凋亡。P53 mRNA较高水平表达于衰老细胞[9-12]。有学者研究发现Rb/P53细胞转导通路相关基因及蛋白在衰老大鼠睾丸组织发生明显改变，衰老大鼠睾丸组织P53、Rb基因表达明显高于正常对照组(P<0.01)[13]。本研究结果显示，自然衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及蛋白表达均显著高于正常组，Rb、P53 mRNA及蛋白表达与衰老呈负相关；艾灸组(温和灸20个月)大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及蛋白表达均显著低于自然衰老组，提示温和灸可抑制衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达。

Bcl-2、PKC为延缓衰老的正相调节因子，参与细胞的增殖、分化、存活与衰亡的调控。Bcl-2多位于细胞内氧自由基产生较多的位置，如线粒体、内质网和核膜等，与细胞的抗氧化自我保护关系密切。Bcl-2对各种刺激诱导的凋亡有阻抑效应，又称为长寿基因，通常被作为衰老检测的参数指标[14]。在衰老细胞里，Bcl-2表达降低[15-17]。有实验表明Bcl-2的过量表达能使多种造血细胞在去除生长因子后寿命延长[18]。PKC广泛分布于哺乳动物的器官、组织和细胞中，参与多种细胞活动调控[19]。活化的PKC能使蛋白质底物上的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，是细胞内信号传导过程中的关键分子之一。在衰老细胞内，PKC的功能失调[20,21]，在细胞衰老的发生发展中起着决定性的作用[22]。本研究中，自然衰老大鼠肝组织Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表达均显著低于正常组；艾灸组(温和灸20个月)大鼠肝组织Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表达均显著高于自然衰老组，提示温和灸可促进衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达。

综上所述，本文研究结果提示：自然衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白表达升高，Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白表达降低。温和灸能抑制Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达，促进Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白的表达，这可能是温和灸延缓衰老的途径之一。

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